慢性鼻-鼻窦炎伴息肉患者AhR表达与Th17反应相关性及AhR配体干预的研究

摘要

慢性鼻-鼻窦炎伴息肉(chronic rhinosinusitis with nasal polyps，CRSwNP)是耳鼻咽喉科临床上常见的、多发的鼻腔和鼻窦粘膜的慢性炎症性疾病。根据目前的流行病学调查显示，CRSwNP在全球范围内的发病率已高达2～5％，其发生严重影响患者的生活和睡眠质量及工作效率，已成为人类主要的公共卫生问题之一，同时也带来了严重的经济负担。虽然CRSwNP目前的诊疗水平已经大幅度提高，但是其治疗效果依然不能令所有患者满意，且治疗后复发率较高。在既往数十年，临床耳鼻喉科医生及科研工作者对CRSwNP的病因、发病机制和治疗进行了深入而广泛的探索和研究。目前认为，CRSwNP患者鼻腔和鼻窦粘膜的慢性炎症主要是由诸如解剖结构异常、感染、变应性体质、免疫调节功能异常等单个或多个因素共同作用所致，其中Th17反应亢进导致的以Th17细胞过度活化及其相应的相关促炎细胞因子的大量释放是造成国人CRSwNP发生发展的重要原因。
　　芳香烃受体(aryl hydrocarbon receptor，AhR)，一种依靠配体激活的转录因子，在调节人体免疫反应中发挥了重要作用。已有研究表明它参与了哮喘、特应性皮炎、实验性自身免疫性脑脊髓炎和类风湿性关节炎等过敏性和自身免疫性疾病的发病机制。近期的动物实验也显示AhR可通过控制T淋巴细胞和树突细胞(dendritic cells，DCs)的分化从而发挥强大的免疫调节能力。尤其值得注意的是，AhR一旦被它的天然配体诸如2-（1-吲哚-3-羰基）-噻唑-4-羧酸甲酯(2-(1'H-indole-3'-carbonyl)-thiazole-4-carboxylic acid methyl ester，ITE)激活，它就能抑制Th17反应，进而控制慢性炎症。因此，我们假设AhR可能参与了CRSwNP患者慢性炎症的形成。
　　本实验的目的是探索AhR在伴变应性体质和不伴变应性体质的CRSwNP患者发病中的作用及其与CRSwNP患者Th17反应的相关性，并予以ITE体外干预CRSwNP患者和健康对照来源的免疫细胞，探讨AhR-DC-Th17信号通路存在的意义，从而寻找到可能治疗该疾病的新的靶点。
　　第一部分 CRSwNP患者鼻息肉组织和外周血AhR与Th17反应相关性研究
　　目的:通过检测AhR在鼻息肉组织和外周血的表达，分析其与患者全身及局部Th17反应的相关性，评估在CRSwNP患者中AhR对Th17反应的调节能力，为深入阐明CRSwNP的发病机制及为治疗该疾病找到新的靶点提供相应的理论依据。
　　方法:收集48例CRSwNP患者（伴变应性体质组/atopic组24例;不伴变应性体质组/non-atopic组24例）的鼻息肉和外周血标本和13例脑脊液鼻漏患者（对照组）的下鼻甲粘膜和外周血标本。检测AhR(RT-qPCR及Western blot检测法)、RORC(RT-qPCR检测法)、IL-17和IL-10(ELISA检测法)的表达水平及Th17细胞的比率（流式细胞术）。
　　结果:CRSwNP患者鼻息肉组织和外周血中AhR的表达水平较对照组显著降低，且atopic组的表达水平较non-atopic组更低，差异有统计学意义;然而，CRSwNP患者鼻息肉组织RORC水平较对照组显著升高，外周血Th17细胞及IL-17水平亦较对照组明显升高，且三者在atopic组的水平均较non-atopic组更高，差异具有统计学意义。CRSwNP患者鼻息肉组织AhR表达水平与RORC及IL-17水平均呈负相关，外周血AhR表达水平与Th17比率及IL-17水平亦呈负相关;而CRSwNP患者鼻息肉组织AhR水平与外周血AhR水平呈高度正相关，鼻息肉组织RORC及IL-17水平与外周血Th17比率及IL-17水平亦呈高度正相关。
　　结论:AhR的表达降低及过度的Th17反应存在于CRSwNP患者的鼻息肉组织及外周血中，由于AhR表达的降低而引起的鼻息肉组织及外周血的Th17反应在CRSwNP患者的发病机制中可能扮演着重要的角色;而atopic组表现为更低的AhR表达及更严重的Th17反应，提示变应性因素可能通过降低AhR表达从而加剧Th17反应。
　　第二部分 AhR配体对CRSwNP患者PBMCs中Th17反应的干预调控研究
　　目的:通过将AhR配体ITE作为干预手段，观察ITE干预的两组CRSwNP患者PBMCs中AhR表达、Th17比率、IL-17和IL-10水平的变化情况，分析AhR-Th17及其相关细胞因子在CRSwNP发生发展中所扮演的角色，并在前一部分实验基础上，体外证实AhR配体ITE可抑制CRSwNP患者的Th17反应，从而达到在一定程度上控制炎症的目的。
　　方法:收集18例CRSwNP患者（atopic组9例;non-atopic组9例）和9例脑脊液鼻漏的外周血标本，分离得到PBMCs后予以ITE干预。采用Western blot检测两组CRSwNP患者PBMCs中AhR表达水平;采用流式细胞术检测PBMCs中Th17细胞比率;采用ELISA检测PBMCs培养上清液中IL-17及IL-10的水平。
　　结果:通过ITE干预后，两组CRSwNP患者PBMCs中AhR表达均升高，而Th17细胞比率和IL-17水平则显著降低。此外，IL-10的水平在ITE干预后显著升高。
　　结论:AhR的表达可在ITE的作用下升高，并参与抑制Th17反应和促进IL-10的产生，揭示了AhR在调控Th17反应中发挥着负调节子的功能，证实了ITE可通过AhR-Th17信号通路抑制CRSwNP患者的炎症反应。
　　第三部分树突细胞和T细胞中AhR及相关细胞因子的表达水平的研究
　　目的:通过检测两组CRSwNP患者及健康对照组外周血来源的DCs和CD4+T细胞AhR表达及相关细胞因子的分泌水平，以期找到免疫调节过程中AhR作用的靶点。
　　方法:收集18例CRSwNP患者（atopic组9例;non-atopic组9例）和9例健康成年人的外周血标本，通过各自磁珠分选得到单核细胞和CD4+T细胞;一方面将单核细胞通过培养7天诱导为DCs;另一方面直接将分选的CD4+T细胞培养3天。采用RT-qPCR和Western Blot方法检测DCs和CD4+T细胞AhR的表达;;采用ELISA检测细胞培养上清液中IL-1β、IL-6、IL-10、和IL-17的水平。
　　结果:CRSwNP患者DCs中AhR的表达水平较对照组显著降低，且atopic组的表达水平较non-atopic组更低，差异有统计学意义;而三组的CD4+T细胞AhR表达无明显差异，经过统计学分析差异无意思。CRSwNP患者DCs分泌促炎性细胞因子IL-1β和IL-6增加，同时抗炎性细胞因子IL-10的分泌减少;而CRSwNP患者CD4+T细胞分泌促炎性细胞因子IL-17增高，而抗炎性细胞因子IL-10的分泌降低;且atopic CRSwNP患者组和Non-atopic CRSwNP患者组细胞因子水平均存在明显的统计学差异。
　　结论:我们的研究表明DCs中AhR的缺陷可能是导致Th17反应的靶点，AhR在DCs的活化可能在调控抗炎反应中起关键作用。此外，AhR的缺陷在伴有atopy的CRSwNP患者更加严重，这也提示我们变应性因素可能也是通过AhR信号通路进而加重CRSwNP患者的Th17反应。
　　第四部分 AhR配体通过干预树突细胞和T细胞抑制CRSwNP患者的Th17反应
　　目的:通过AhR配体ITE干预两组CRSwNP患者外周血来源的DCs和CD4+T细胞，分析ITE通过AhR-DCs-CD4+T细胞轴和AhR-CD4+T细胞轴对Th17反应的影响。
　　方法:收集20例CRSwNP患者（atopic组10例;non-atopic组10例）和12例健康成年人的外周血标本，通过各自磁珠分选得到单核细胞和CD4+T细胞;一方面将单核细胞诱导为DCs，并予以ITE干预后与CD4+T细胞共培养;另一方面直接予以ITE干预CD4+T细胞。采用RT-qPCR方法检测DCs和CD4+T细胞AhR的表达;采用流式细胞术检测Th17细胞比率;采用ELISA检测细胞培养上清液中IL-1β、IL-6、IL-10、和IL-17的水平。
　　结果:予以ITE干预DCs后，能显著抑制DCs分泌促炎性细胞因子IL-1β和IL-6的分泌，同时促进抗炎性细胞因子IL-10的分泌;予以ITE干预CD4+T细胞后，能明显抑制CD4+T细胞分泌促炎性细胞因子IL-17和促进抗炎性细胞因子IL-10的分泌;同时抑制Th17细胞的分化。
　　结论:ITE可通过作用于DCs和CD4+T细胞从而抑制Th17反应并控制CRSwNP患者的炎症反应;AhR-DCs-Th17细胞轴可能是治疗CRSwNP患者的重要信号通路。ITE作为一种无毒的AhR配体，能够在体外明显抑制CRSwNP患者的Th17反应，因此，它将来可能成为治疗CRSwNP患者的潜在候选药物。

目录

声明

英汉缩略语名词对照

摘要

前言

第一部分 CRSwNP患者鼻息肉组织和外周血AhR与Th17反应的相关性研究

前言

1 实验材料与方法

2 结果

3 讨论

参考文献

第二部分 AhR配体对CRSwNP患者PBMcs中Th17反应的干预调控研究

前言

1 实验材料与方法

2 结果

3 讨论

参考文献

第三部分 树突细胞和T细胞中AhR及相关细胞因子表达水平的研究

前言

1 实验材料与方法

2 结果

3 讨论

参考文献

第四部分 AhR配体通过干预树突细胞和T细胞抑制CRSwNP患者的Th17反应

前言

1 实验材料与方法

2 结果

3 讨论

参考文献

全文总结

研究的创新性与展望

文献综述 芳香烃受体在免疫反应中的作用

致谢

博士期间发表论文