RA促进肠上皮Caco-2细胞间紧密连接的机制研究

摘要

本研究分为二部分：
　　第一部分：RA促进肠上皮细胞Caco-2之间的紧密连接
　　目的：明确RA对Caco-2细胞紧密连接的促进作用，筛选RA最佳作用浓度，探索RA信号通路中RARs与TLRs和紧密连接相关蛋白在RA促进Caco-2细胞发挥屏障功能中的变化。
　　方法：利用电压电阻仪检测RA处理后的Caco-2细胞跨上皮电阻(TER)的变化。给予不同RA浓度(0.5μmol/L、1μmol/L、5μmol/L、10μmol/L、20μmol/L)处理Caco-2细胞，Real-time PCR和Western blot技术检测分析RA作用后Caco-2细胞中RARs、TLRs和紧密连接相关蛋白的表达水平变化。免疫荧光染色观察RA作用Caco-2细胞后关键受体RARβ的定位表达差异。
　　结果：RA处理显著增加Caco-2细胞跨上皮电阻，与未处理组比较具有统计学差异，P＜0.01。不同浓度RA(0.5μmol/L、1μmol/L、5μmol/L、10μmol/L、20μmol/L)分别处理Caco-2细胞后，Real-time PCR检测结果显示RARβ、TLR4和ZO-2的mRNA表达水平均较RA未处理组有明显升高，且RA为1-10μmol/L时效果最为显著(P＜0.05，P＜0.001);Western blot进一步分析RARβ、TLR4和ZO-2三个蛋白表达水平变化，其结果与real-time PCR检测分析完全一致。但不同浓度 RA对RARα、RARγ和TLR2，以及Occludin、ZO-1的表达水平并没有明显的改变。同时，免疫荧光染色观察到未经RA处理的Caco-2细胞中RARβ多定位于细胞核膜周边;随着RA作用浓度的不断升高，发现RARβ在胞浆中的表达逐渐增加，由核膜周边聚集的RARβ逐渐移向胞浆。
　　结论：RA增加Caco-2细胞的跨上皮电阻，促进其紧密连接，其机制可能是通过RARβ信号通路，上调TLR4和紧密连接蛋白ZO-2的表达水平，从而实现RA促进肠上皮屏障的保护作用。
　　第二部分：RARβ调节TLR4促进Caco-2细胞紧密连接蛋白ZO-2的表达
　　目的：利用Ad-RARβ和siRARβ重组腺病毒研究RARβ调控RA促进Caco-2细胞紧密连接的作用，通过免疫共沉淀(Co-IP)和染色质免疫共沉淀(ChIP)探索RARβ、TLR4和ZO-2三者之间的相互作用关系，寻找RARβ促进ZO-2表达的具体调控机制。
　　方法：重组Ad-RARβ和siRARβ腺病毒分别感染Caco-2细胞后，Real-time PCR和Western blot检测分析RARβ、TLR4和ZO-2三者的表达水平变化。通过免疫共沉淀(Co-IP)技术，分别利用RARβ抗体和ZO-2抗体免疫沉淀细胞中与之结合的蛋白，Western blot检测发生免疫共沉淀的目的蛋白。运用染色质免疫共沉淀(ChIP)技术，通过RARβ抗体沉淀Caco-2细胞中DNA-蛋白交联复合物，Real-time PCR检测分析经RARβ抗体富集的DNA序列表达水平的差异。
　　结果：重组腺病毒Ad-RARβ感染Caco-2细胞后，Real-time PCR和Western blot检测结果显示，RARβ mRNA和蛋白表达水平均有明显升高，较RFP对照组具有显著性的差异，P＜0.001;同时TLR4和ZO-2的表达水平也随之显著性上调;当siRARβ感染阻断RARβ的表达水平时，Caco-2细胞中TLR4和ZO-2的蛋白表达水平也随之降低，较RFP对照组相比具有统计学差异（P＜0.05，P＜0.01）。Co-IP检测结果发现，RARβ抗体可沉淀Caco-2细胞中TLR4蛋白，ZO-2抗体可沉淀细胞中TLR4蛋白，表明在Caco-2细胞中RARβ蛋白与TLR4蛋白相互结合，TLR4蛋白与ZO-2蛋白相互结合;但RARβ与ZO-2之间没有蛋白-蛋白间的相互作用。进一步利用ChIP技术研究表明，RARβ可与胞内TLR4启动子区相结合，但与ZO-2启动子区不存在相互作用。
　　结论：利用重组腺病毒分别过表达和沉默RARβ，证实RA通过RARβ信号通路的激活，上调TLR4和ZO-2的表达水平，从而实现RA促进Caco-2细胞紧密连接的作用。其分子机制是RA核受体RARβ可结合在TLR4启动子区调控TLR4的表达水平，而TLR4亦可与ZO-2发生蛋白-蛋白间的相互作用，即RARβ通过调控TLR4进而上调ZO-2的表达水平，促进上皮屏障保护功能。

目录

声明

英汉缩略语名词对照

摘要

前言

参考文献

第一部分 RA促进肠上皮细胞Caco-2之间的紧密连接

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

4 小结

参考文献

第二部分 RARβ调节TLR4促进Caco-2细胞紧密连接蛋白ZO-2的表达

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

4 小结

参考文献

全文总结

文献综述 ZO蛋白的结构和作用研究进展

致谢

攻读硕士学位期间发表的学术论文及参加的学术交流