粪肠球菌感染根管形成根尖生物膜及根管预备对其影响的体外研究

摘要

在口腔细菌学研究发展愈加前沿以来，国内外大量学者研究表明根尖周炎的发病来源中最重要的是细菌的影响[1]。而细菌生物膜由依靠胞外产物（如多糖及蛋白质）而粘附于固体表面的细菌群落组成。细菌生物膜能够通过结合有机和无机成分，形成稳定的生物群落从而产生相互影响及作用[2]。因此，从细菌学的角度看，生物膜为细菌提供了一个稳定的生存环境，起到了屏障作用以及占位性保护作用，从而使细菌不那么容易被破坏，以此显著提高细菌的生存能力及外界抵抗力[3,4]。现阶段，关于牙体牙髓疾病和牙周病中的细菌生物膜的实验，大多数为根管里面的生物膜以及牙颈部和牙齿表面的菌斑生物膜[5,6]。但是由于根尖及牙周的组织和细菌难以取材，因此对于感染根管形成根尖周炎和根尖生物膜的原因尚未完全明了。Plakunov研究发现：当有外界刺激干扰感染根管时，稳定的细菌生物膜会释放出游离的细菌，从而导致再次感染甚至在其他部位繁殖形成新的[7]。在牙体牙髓疾病致病菌中，粪肠球菌（E.faecalis）的检出率在治疗前与治疗后有着明显差异,特别是在根尖周疾病中，许多研究证明粪肠球菌是难治性根尖周炎的优势菌[8,9]。本课题小组的前期研究显示，对于暴露在空气中所形成的感染根管，根管下段以下的预备对根尖生物膜的形成有促进作用。本实验利用前期实验完成的体外模型形成粪肠球菌感染根管[10]，在不考虑机体免疫机制的条件下，研究根管预备对粪肠球菌感染根管形成根尖周炎的影响，为临床预防根尖生物膜的形成提供参考。
　　目的：
　　感染根管内粪肠球菌的体外模型的建立，探讨根管预备对根尖细菌渗漏的体外细菌生物膜的形成条件的影响。
　　材料和方法：
　　1.离体牙拣选：正畸患者的健康前磨牙选择：二十。模型制作：将离体牙各自密封于盛有BHI琼脂培养基的无菌小瓶内，使其根尖四毫米浸没于培养基中。随机抽取10个作为实验组进行开髓，之后将粪肠球菌接种于髓腔。于建模后21d将标本戊二醛固定后酒精梯度脱水，石蜡包埋后，分别对牙颈部、根中1/3及根尖1/3进行组织切片，厚度为7μm。切片经Brown and Brenn染色法（改良革兰氏染色法）染色后，置于光学显微镜下从低到高的倍数进行观察，记录观察结果并保存图片。
　　2.离体牙选择：因正畸情况而拔除的健康双尖牙三百二十颗。模型制作：将离体牙各自密封于盛有BHI琼脂培养基的无菌小瓶内，使其根尖四毫米浸没于培养基中。建模后将其随机分为对照组A（n=70）、实验组（n=250）。实验组做开髓处理后接种粪肠球菌，对照组不做任何处理。全部置于三气培养箱中（含5％O2，85%N2，10%CO2；温度37℃）。在做干扰前先将320个模型放置21d，并于1d及21d分别利用16SrRNA通用引物PCR法检测根尖周细菌。确保体外模型未被细菌感染后随机将实验组分为组B、C、D、E。B组为开髓组，C组为根管上2/3干扰组， D组为全长干扰组，E组为超长干扰组。5组分别于干扰后1d，7d，21d，35d，49d，63d进行PCR检测（期间每两天用灭菌针管通过开髓孔滴入新鲜灭菌BHI液态培养基）。根据结果利用SEM进行Ef根尖生物膜观察并对根尖周细菌进行细菌培养。
　　结果：
　　1.建立模型后二十一天利用16SrDNA通用引物PCR检测根管内及根尖周细菌，对照组根管内及根尖周均未检测到细菌；实验组根管内检测到粪肠球菌，并且组织切片Brown&Brenn染色可见粪肠球菌感染根管样本的牙本质小管中有深浅、长短不一的染色，证明牙本质小管中有粪肠球菌定植。说明粪肠球菌感染根管的体外模型建模成功。
　　2.确定建模成功后，分别对5组于干扰1d，7d，21d，35d，49d，63d进行粪肠球菌16SrRNA的PCR检测。其中A、B、C组始终未检测到粪肠球菌；组D于7d检测到；组E于1d检测到。SEM下可以观察到D组及E组的根尖周粪肠球菌生物膜。
　　结论：
　　1.粪肠球菌感染根管体外模型，经组织学切片后Brown&Brenn染色。结果证实在粪肠球菌接种于髓腔中21天后，可形成粪肠球菌感染根管。
　　2.本离体实验显示，根管预备与根尖周生物膜的产生为正相关非必要关系。对于粪肠球菌感染根管，在根管及根管下段未受干扰的情况下，细菌不会轻易穿出根尖孔，当根管下段受到干扰后，细菌会穿出根尖孔并形成根尖生物膜。

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中文摘要

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前言

第一部分 建立粪肠球菌感染根管体外模型

1 材料

2方法

3 结果

4 讨论

第二部分 粪肠球菌经根管形成根尖生物膜以及根管预备对其的影响的体外研究

1 材料

2方法

3 结果

4 讨论

全文总结

参考文献

文献综述: 口腔微生物膜体外模型建立的研究进展

致谢

攻读学位期间发表论文及参与科研情况