凋亡诱导因子及其突变体的腺病毒载体构建和对K562细胞凋亡的影响

摘要

慢性粒细胞白血病（Chronic Myeloid Leukemia,CML）是由于9号染色体与22号染色体易位形成Bcr-Abl融合基因而引起的恶性血液肿瘤，该融合基因编码产生具有强酪氨酸激酶活性的BCR-ABL蛋白，该蛋白可通过激活下游多条信号通路，发挥促进细胞增殖和抑制细胞凋亡的作用。因此，研究CML细胞凋亡被抑制的分子机制对CML发病机制及治疗具有重要意义。
　　凋亡诱导因子（ Apoptosis-Inducing Factor, AIF）是参与非依赖caspase凋亡途径的重要分子，它是一种黄素蛋白，正常情况下定位在线粒体内膜上，起着电子传递的作用，参与能量代谢。当细胞受到凋亡刺激后，AIF从线粒体异位到细胞浆，最后进入细胞核，将DNA切割成约50 kb的大片段，导致细胞凋亡。经研究发现，AIF从线粒体释放与线粒体膜的通透性、钙蛋白酶等有关，Luigi等在 Apaf1-/- HeLa细胞中发现热休克蛋白-70（Heat Shock Protein-70, HSP70）能够阻止AIF入核，从而阻止细胞发生凋亡样细胞死亡。然而，AIF在CML细胞凋亡被抑制中的作用机制尚不清楚。
　　为了进一步了解AIF在CML发病中的作用，我们的研究思路是：构建野生型凋亡诱导因子（Ad-Apoptosis-inducing factor，Ad-AIF）、缺线粒体定位信号结构域的凋亡诱导因子突变体（Ad-Apoptosis-inducing factor defected mitochondria localization sign, Ad-DMLS-AIF）和缺HSP70结合位点的凋亡诱导因子突变体（ Ad-Apoptosis-inducing factor-defected HSP70 banding domain, Ad-DHBD-AIF）的重组腺病毒载体，感染白血病 K562细胞后，观察 Ad-AIF、Ad-DMLS-AIF和Ad-DHBD-AIF对慢粒白血病K562细胞凋亡的作用，探讨AIF与CML细胞凋亡异常之间的关系。
　　主要的实验内容及方法：
　　1.构建Ad-AIF、Ad-DMLS-AIF和 Ad-DHBD-AIF重组腺病毒载体。
　　将 K562细胞的cDNA作为模板，通过PCR得到的AIF、DMLS-AIF和DHBD-AIF片段分别克隆至穿梭载体pAd-Track-CMV-HA质粒中，经双酶切、PCR和测序鉴定后，分别与骨架质粒pAd-Easy1重组，得到的重组腺病毒质粒分别经PacⅠ线性化后，转染AD293细胞，进行包装和扩增，即得到Ad-AIF、Ad-DMLS-AIF和 Ad-DHBD-AIF重组腺病毒，同时将 pAd-Easy1质粒进行包装和扩增，得到空载腺病毒，作为实验对照。在空载腺病毒和三种重组腺病毒感染 K562细胞48 h时，通过western blot验证其在K562细胞中的表达。
　　2.观察Ad-AIF、Ad-DMLS-AIF和 Ad-DHBD-AIF对K562细胞凋亡的影响。
　　在空载腺病毒和三种重组腺病毒感染K562细胞0 h、24 h、48 h、72 h时，使用CCK-8检测各组腺病毒对K562细胞生长抑制的程度；在48 h时，通过Hoechst33258染色观察K562细胞核形态的改变，流式细胞术检测K562细胞凋亡情况；在24 h时，免疫荧光染色检测重组腺病毒表达蛋白在 K562细胞中的定位，免疫共沉淀检测 AIF、DMLS-AIF和DHBD-AIF是否与HSP70相结合。
　　通过以上方法，我们得到以下结果：
　　1.通过双酶切、PCR和测序鉴定，构建的穿梭质粒正确；PacⅠ酶切得到特异性的大小为4.5 kb的 DNA片段，说明 Ad-AIF、Ad-DMLS-AIF和 Ad-DHBD-AIF构建成功；Western blot检测到三种重组腺病毒在K562细胞中的表达。
　　2. CCK-8实验结果显示与未处理组、空载腺病毒组、Ad-AIF组和Ad-DMLS-AIF组相比，随着时间的增加， Ad-DHBD-AIF对K562细胞生长抑制程度也增加。Hoechst33258染色发现 Ad-DHBD-AIF引起K562细胞染色质凝集，而未处理组、空载腺病毒组、Ad-AIF组和Ad-DMLS-AIF组的K562细胞染色质分布均匀；流式细胞术检测发现Ad-DHBD-AIF引起K562细胞凋亡的数目明显高于未处理组、空载腺病毒组、Ad-AIF组和 Ad-DMLS-AIF组。免疫荧光染色检测发现， DHBD-AIF能进入细胞核，AIF和Ad-DMLS-AIF均滞留于胞浆中；免疫共沉淀检测发现 AIF和 DMLS-AIF均能与 HSP70相结合，而DHBD-AIF不结合HSP70。
　　综上所述，三种重组腺病毒构建成功，感染K562细胞后，与未处理组、空载腺病毒组、Ad-AIF组和 Ad-DMLS-AIF组相比， Ad-DHBD-AIF能够引起K562细胞发生明显凋亡，其表达的蛋白不与HSP70结合，并且能够进入细胞核，说明在K562细胞中，AIF与HSP70结合可使 AIF滞留于胞浆中，不能发挥促凋亡的作用，从而表现出抵抗凋亡的现象。

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英汉缩略语名词对照

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英文摘要

前言

第一部分 凋亡诱导因子及其突变体的腺病毒载体构建

1 材料和方法

1.1主要材料

1.2 实验方法

2 结果

2.1 AIF、 DMLS-AIF和DHBD-AIF基因的扩增和鉴定

2.2 重组腺病毒穿梭载体的鉴定

2.3 重组腺病毒质粒鉴定

2.4 重组腺病毒的包装和扩增

2.5 重组腺病毒滴度的测定

2.6 重组腺病毒介导的AIF及其突变体在白血病K562细胞中的表达验证

3讨论

第二部分 凋亡诱导因子及其突变体重组腺病毒对K562细胞凋亡的影响

1 材料及方法

1 .1材料

1.2方法

2 结果

2.1 CCK-8检测Ad-AIF、Ad-DMLS-AIF和Ad-DHBD-AIF腺病毒对K562细胞的影响

2.2 Hoechst33258 染 色 检 测 Ad-AIF 、 Ad-DMLS-AIF 和Ad-DHBD-AIF对K562细胞凋亡的影响

2.3 流式细胞术检测 Ad-AIF、 Ad-DMLS-AIF 和 Ad-DHBD-AIF 对K562细胞凋亡的影响

2.4 重组腺病毒在K562细胞内的定位

2.5 免疫共沉淀分析 AIF、DMLS-AIF 和 DHBD-AIF 是否与 HSP70结合

3讨论

全文总结

参考文献

文献综述： 凋亡诱导因子在细胞凋亡中的作用研究进展

致谢

攻读硕士期间发表的学术论文