Gadd45b在缺血性脑卒中和卒中后脑可塑性中的作用

摘要

目的：生长阻断及 DNA损伤诱导因子45b（Growth arrest and DNA-damage inducible protein beta，Gadd45b）属于Gadd45家族，被证实与神经元活动有关，这与神经的发生密切的相关。大鼠的脑缺血再灌注损伤可以诱导 Gadd45b在蛋白和核酸水平的表达，Gadd45b介导了神经元的凋亡，可能与轴突可塑性和卒中后脑康复有关。细胞的死亡方式包括了凋亡、自噬和坏死。自噬性细胞死亡作为 II型程序性细胞死亡，被证实参与了脑缺血再灌注损伤这一病理过程。然而，在此病理过程中 Gadd45b对自噬的作用并不清楚。此外，在脑缺血中， Gadd45b可以促进脑源性神经营养因子（ brain derived neurotrophic factor，BDNF）的表达，与轴突的可塑性而相关，Gadd45b在脑缺血中可能起着促进康复的作用。然而，在脑缺血病理过程中， Gadd45b表达的分子调控机制尚不清楚。泛素-蛋白酶系统（Ubiquitin-proteasome system，UPS）广泛调控了细胞内蛋白的降解。Gadd45的表达受到了泛素化方式的调控。但是，脑缺血再灌注损伤如何诱导 Gadd45b表达及所涉及的具体机制也不清楚。本研究以进一步探讨和分析在脑缺血再灌注损伤的病理过程中 Gadd45b对自噬的作用和可能的作用机制，以及泛素化系统Huwe1对Gadd45b的作用，以及两者在卒中后脑可塑性中的作用机制。
　　方法：采用大鼠皮层神经元原代培养，并予以缺氧缺糖/再灌注处理（oxygen-glucose deprivation and reperfusion, OGD/R），即OGD3 h和再灌注0h、6h、24h、48h、72h和120h。CCK-8和LDH试剂盒用于检测皮层神经元的细胞活性和损伤情况。构建慢病毒shRNA-Gadd45b沉默Gadd45b的表达，利用蛋白印迹技术检测自噬分子（ATG5、LC3、Beclin-1、ATG7、ATG3）、凋亡通路分子（Bax、Bcl-2、Cleaved caspase3、p53）以及JNK/p38信号通路的表达变化。同时，给予自噬抑制剂或 JNK/p38通路抑制剂共处理，检测相关分子的蛋白表达变化情况，并利用TUNEL技术检测皮层神经元细胞的凋亡情况。利用神经元标记物Tuj1和LC3B免疫荧光染色双标技术检测神经元的轴突损伤。此外，构建慢病毒shRNA-Huwe1沉默Huwe1的表达变化，采用CO-IP检测Huwe1和Gadd45b的相互作用，进行CHX处理检测Huwe1对 Gadd45b蛋白稳定性的分析，采用 BSP检测 Huwe1和Gadd45b对BDNF IXa甲基化的作用，采用western blot技术检测Huwe1和Gadd45b对BDNF及其受体TrkB和p75NTR和下游效应分子的影响。
　　结果：在OGD/R处理神经元细胞后，皮层神经元的细胞活性降低，随着再灌注时间的延长而逐渐降低。Gadd45b在OGD/R24 h时表达最高，给予慢病毒shRNA沉默Gadd45b后，Gadd45b在再灌注24 h时表达明显的降低，增加了自噬通路的信号分子（Beclin-1、ATG5、ATG7和ATG3）、LC3 II/LC3 I的比值和凋亡蛋白Bax和Cleaved caspase3的表达，但是降低了抗凋亡蛋白 Bcl-2的表达。与此同时，慢病毒shRNA-Gadd45b和自噬通路抑制剂3-MA或Wortmannin共处理后，可部分抑制 LC3 II/LC3 I的比例，轻微缓解了神经元的凋亡。沉默Gadd45b表达后，自噬相关通路p-p38磷酸化水平降低，而凋亡相关通路p-JNK磷酸化水平增加。给予慢病毒shRNA-Gadd45b和p38通路抑制剂共处理后则明显诱导了自噬，而给予慢病毒 shRNA-Gadd45b和JNK通路抑制剂共处理后则明缓解了细胞凋亡。OGD/R24 h后，沉默Huwe1表达后明显增加了Gadd45b和BDNF的表达。CO-IP结果表明Huwe1和Gadd45b存在相互作用。通过CHX处理后抑制了内源性的Gadd45b的表达，CHX和慢病毒 shRNA-Huwe1共处理后则增加了Gadd45b的表达。慢病毒shRNA-Gadd45b处理后降低了BDNF和下游效应分子的表达，而慢病毒 shRNA-Huwe1处理后增加了 BDNF和下游效应分子表达。沉默Huwe1表达后降低了BDNF IXa第五个CpG岛甲基化水平，而沉默Gadd45b表达后则增加了BDNF IXa第四个CpG岛甲基化水平。
　　结论：在皮层神经元OGD/R的病理过程中Gadd45b调节了凋亡和自噬， Gadd45b的表达受到了泛素-蛋白酶体系统 Huwe1的调节， Gadd45b和Huwe1介导了BDNF IXa的甲基化。这可能为缺血性脑卒中的病理过程的研究提供新的理论基础，为日后的临床治疗提供可能的靶点。

目录

封面

声明

目录

英汉缩略语名词对照

中文摘要

英文摘要

前言

第一部分Gadd45b在缺血性脑卒中中的作用

前言

1.材料与方法

2.结 果

3.讨 论

小结

参 考 文 献

第二部分Gadd45b在卒中后脑可塑性的作用

前言

1.材料与方法

2.结果

3.讨论

小结

参 考 文 献

全 文 总 结

综述: Gadd45b在缺血性脑卒中中的研究进展

致谢

攻读学位期间发表的论文