皮秒脉冲电场对宫颈癌血管生成的影响及机制的体外实验研究

摘要

脉冲电场(pulsed electric field, PEF)是近年来新出现的一种微创、可消融肿瘤的技术，利用脉冲波不仅可以直接导致细胞发生肿胀破裂，同时可引发细胞发生凋亡。而其最新的研究进展发现，当脉冲波的脉宽降低至皮秒时，可使用特殊构建的、能够发射超宽带冲击脉冲的辐射天线实现无创聚焦，即皮秒脉冲电场(picosecond pulse electric field, psPEF)。因此，皮秒脉冲电场在生物医学领域特别是肿瘤治疗方面，受到了人们越来越多的关注和研究。
　　在肿瘤生长、发展和转移的过程中，血管的作用是至关重要的。当现有血管无法满足肿瘤生长所需时，肿瘤会产生血管生成相关因子，形成新生血管。肿瘤中血管的形成包括内皮细胞的增殖、定向迁移、管腔形成等复杂过程，同时，血管生成促进因子和抑制因子之间的平衡可精密调控肿瘤血管形成。目前研究发现，血管内皮生长因子VEGF和缺氧诱导转录因子HIF1α是血管形成的重要促进因素。
　　本课题组前期研究表明，皮秒脉冲电场对人宫颈癌HeLa细胞有抑制生长和诱导其发生凋亡的作用，然而，其对肿瘤血管生成的影响尚未见有相关报道。为探讨皮秒脉冲电场对肿瘤及其周围血管的影响，本实验以人脐静脉内皮细胞（HUVEC）和人宫颈癌HeLa细胞为研究对象，以低、中、高场强的皮秒脉冲(200kv/cm、400kv/cm、600kv/cm)为处理方式，应用CCK-8法、Transwell小室法、划痕实验、管腔形成实验、流式细胞计数法检测皮秒脉冲电场处理后对HUVEC增殖、迁移、管腔形成、周期及凋亡的影响；利用Real-time PCR、Western Blot在分子层面上探讨皮秒脉冲电场作用HeLa细胞后其血管生成相关因子mRNA及蛋白表达水平的变化。探讨皮秒脉冲电场对宫颈癌血管生成的影响及可能的分子机制，为后续的动物实验提供科学依据。
　　第一部分皮秒脉冲电场对人脐静脉内皮细胞生物学行为的影响
　　目的：探讨皮秒脉冲电场对HUVEC细胞增殖、迁移、管腔形成、周期及凋亡的影响
　　方法：将 HUVEC细胞分为四个组：对照组和低、中、高场强即200kV/cm,400kV/cm,600kV/cm作用的实验组。皮秒脉冲电场的参数为：固定脉宽800ps，频率3Hz，脉冲个数2000个。在皮秒脉冲电场处理HUVEC细胞后2h、4h、6h、8h、10h、12h、14h、16 h，CCK-8法检测皮秒脉冲电场对HUVEC细胞生长的影响；采用划痕试验及Transwell小室法观察皮秒脉冲电场对HUVEC细胞迁移率的影响；管腔形成实验观察HUVEC细胞血管管腔形成的变化；流式细胞术检测皮秒脉冲电场对HUVEC细胞周期及凋亡的作用。
　　结果：皮秒脉冲电场处理HUVEC后，随着场强的增加，细胞死亡率上升，生长受到抑制，12h时抑制率最为显著；皮秒脉冲电场可明显抑制HUVEC细胞的迁移能力和血管管腔形成；皮秒脉冲电场可将HUVEC阻滞于G2/M期,同时HUVEC凋亡细胞数增多。
　　结论：皮秒脉冲电场可抑制HUVEC细胞增殖、迁移和管腔形成，并阻滞细胞周期于G2/M期，促进其凋亡。
　　第二部分皮秒脉冲电场对人宫颈癌HeLa细胞产生血管生成相关因子的影响
　　目的：探讨皮秒脉冲电场对人宫颈癌HeLa细胞产生血管生成相关因子的影响。
　　方法：将 HeLa细胞分为四个组：对照组和低、中、高场强即200kV/cm,400kV/cm,600kV/cm作用的实验组。皮秒脉冲电场的参数为：固定脉宽800ps，频率3Hz，脉冲个数2000个。在皮秒脉冲电场处理HeLa细胞后在37℃，5％CO2孵箱中继续培养12 h，Real-time PCR和 Western blot从转录和翻译水平检测血管生成相关因子HIF1α， VEGF的表达。
　　结果：皮秒脉冲电场作用后，HIF1α，VEGF在转录和翻译水平均表达下调。
　　结论：皮秒脉冲可减少HeLa细胞中VEGF、HIF1α的表达，其结果可能与HIF1α-VEGF信号通路相关。

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前言

参考文献

第一部分 皮秒脉冲电场对人脐静脉细胞生物学行为的影响

1材料与方法

2结果

3讨论

4结论

参考文献

第二部分 皮秒脉冲电场对人宫颈癌HeLa细胞产生血管生成相关因子的影响

1材料与方法

2结果

3讨论

4.结论

参考文献

全文总结

附图

文献综述: 肿瘤抗血管生成治疗耐药机制研究进展

致谢

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