利用催化发夹组装的生物传感器检测目标DNA和人源性α-凝血酶

摘要

目的：
　　肿瘤相关DNA存在于患者的血液、唾液、尿液和其他分泌液中，与正常DNA相比，其往往会发生碱基突变，而检测目标DNA的碱基突变有助于肿瘤的筛查和肿瘤远处转移的检测。由于肿瘤早期体液中的肿瘤DNA表达量很少，因此，寻找一种灵敏、特异的识别方法用于检测目标DNA的浓度对早期诊断肿瘤有着非常重要的意义。
　　α-凝血酶是一种丝氨酸蛋白酶，它主要参与血液凝血过程，有促凝和抗凝的双重作用，其在体内的异常表达与血栓性疾病的发生直接相关。然而，目前用于α-凝血酶的检测方法却存在操作繁琐、试剂价格昂贵、不够灵敏等问题。
　　本研究利用串联的分支整合DNA耦合催化发夹组装反应（CHA）制成的生物传感器可直接检测目标DNA以及人源性α-凝血酶，同时，对传感器的可行性、灵敏度和特异性进行了分析。
　　方法：
　　1．串联体分支整合DNA的形成：目标物分子存在的条件下，打开第一条DNA发夹H1，H1暴露出能打开发夹H2的序列并打开发夹H2，H2暴露出的序列打开发夹H1进入下一个循环，最终形成一系列串联体分支整合DNA。当缺乏目标物时，2种发夹DNA独立存在于同一体系中，相互之间不发生反应。
　　2．CHA反应：串联体分支整合DNA上含有自由的紧密靠近的触发链，可触发C HA的发生。由于一个目标物分子可引发一条串联分支整合DNA链形成，而一条分支整合DNA链含有多个触发链，从而触发多个C HA反应，实现第一次信号放大。
　　3．类过氧化物酶催化底物反应和信号进一步放大：CHA发生后，每一条双链 DNA产物末端都含有 G-四聚体结构，当加入血红素后，G-四聚体被激活并具有类过氧化物酶的活性。在过氧化氢存在下，其催化ABTS发生氧化还原反应，从而在418 nm处形成特征性吸收峰。
　　4．可行性分析：利用非变形聚丙烯酰胺凝胶电泳和紫外可见分光光度计表征可行性。
　　5．传感器检测的条件优化及性能评价：对 H1与目标DNA之间互补碱基的长度、H2与H3浓度、CHA的孵育时间和孵育温度进行优化；对传感器的灵敏度、特异性进行评价。
　　结果：
　　1．非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳结果表明，分步的串联体分支整合DNA反应以及 CHA反应可行。紫外可见分光光度计进一步证明目标物分子引发串联体分支整合DNA反应，进而由串联体上的引发物链引发CHA的一体化反应可行。
　　2．目标物分子加入后触发信号放大反应体系，产生的具有类过氧化物酶活性的G-四聚体DNAzyme催化底物并在418 nm处产生特征性吸收峰，根据吸收峰强度随浓度的变化制定了标准曲线。
　　3．基于串联体分支整合 DNA及 CHA的传感器性能：检测目标DNA分子的线性范围是1.0 pM到75 nM，检测下限为0.14 pM（S/N=3）；检测人源性α-凝血酶的线性范围是1.0 pM到2.5 nM,检测下限为0.68 pM（S/N=3）；具有单碱基突变识别能力。
　　结论：
　　本实验研究利用串联体分支整合DNA及CHA构建了一种新的生物传感器检测目标DNA分子以及人源性α-凝血酶，在这一反应体系内，比色反应的灵敏度得到显著提高；在近端错配识别的作用下，展现出了很高的特异性，实现了单碱基错配识别性能；和传统比色实验相比，本实验设计的传感器具有低检测限、高特异性、操作简便，无需冲洗等步骤；本传感器在临床生物医学研究，肿瘤标志物检测，法医检测中具有很高的应用潜力。

目录

声明

符号说明

前言

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

1.2比色核酸生物传感器的制备

1.3 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳实验

2 结果与分析

2.1比色传感器制备过程的表征

2.2比色传感器的可见光表征

2.3比色生物传感器的条件优化

2.4比色生物传感器的分析性能评价

2.5 生物传感器的特异性评价

2.6 比色传感器的通用性

2.7 方法学比较

全文总结

参考文献

文献综述:DNA纳米技术在制备生物传感器中的应用与展望

致谢

攻读学位期间的科研成果及发表的学术论文