PRDX2对5-氟尿嘧啶在结肠癌细胞中化疗敏感性的调控作用及机制研究

摘要

结肠癌是目前肿瘤疾病中全球发病率较高的肿瘤，在我国的新发肿瘤病例及肿瘤死亡病因中均排第5位，并且结肠癌的发病率和死亡率仍然呈上升趋势。目前结肠的治疗是以手术为主，辅以全身化疗。全身辅助化疗的目的是为术后进一步消灭患者体内的微转移病灶，延长病人的生存时间，并且辅助化疗被认为是中晚期结肠癌患者综合治疗的重要环节。5-氟尿嘧啶（5-FU）是结肠癌化疗的首选药物，被广泛的运用于结肠癌的辅助化疗中。患者对化疗药物的敏感性决定了化疗的疗效，许多病人常常因为对5-FU耐药导致治疗的失败。因此研究影响化疗药物敏感性的分子生物机制，进一步筛选出更好的靶点以促进化疗药的敏感性在结肠癌的治疗中就显得尤为重要。最近有研究表明，机体的活性氧（ROS）清除系统能降低人体对5-FU的药物敏感性。过氧化还原蛋白（PRDXs）属于ROS清除系统，在肿瘤对抗ROS的过程中发挥了极为重要的作用，PRDX2是其中的一个重要成员。有研究表明，PRDX2在结肠癌中过表达，并且下调PRDX2可以促进结肠癌细胞的凋亡。PRDX2能清除体内过多的ROS，并且能调控结肠癌细胞的凋亡，而ROS又与5-FU的药物敏感性有关，这些研究提示PRDX2可能对5-FU在结肠癌化疗中的敏感性产生影响。而在结肠癌化疗中PRDX2与5-FU的相互关系及其影响机制尚未有进一步的研究，我们的研究就对此展开。 研究目的： 探讨PRDX2对5-FU在结肠癌中化疗敏感性的影响及其机制 研究方法： 1.建立沉默PRDX2的质粒载体并用慢病毒包装，通过Western blot筛选有效的质粒载体，通过RNA的提取和QT-PCR的检测验证慢病毒干扰后PRDX2的敲减效率；通过慢病毒转染HT29和HCT116结肠癌细胞，分别建立空载病毒组（shCont组）和沉默PRDX2组（shPRDX2组），通过荧光显微镜观察慢病毒转染率，采用Western blot检测慢病毒转染后PRDX2蛋白水平的差异，用QRT-PCR检测mRNA表达的差异。 2.在96孔板中用不同浓度的5-FU处理慢病毒干扰后的两组细胞，5-FU的浓度分别为0、2.5、5、10、20、40、80ug/ml，48小时后进行细胞计数分析（Cell Counting Kit-8(CCK-8) assay），测定慢病毒干扰后结肠癌细胞的存活率。 3.用流式细胞仪检测慢病毒干扰后，再经过5-FU处理的不同的结肠癌细胞的凋亡率；用Western blot检测两组中细胞凋亡后裂解的PARP(C-PARP)和caspase-3的表达量，对比两组中的差异。 4.体内试验中，我们将裸鼠分为空载病毒组(shCont组)、沉默PRDX2组（shPRDX2组）、5-FU处理的空载病毒组（shCont+5-Fu）和5-FU处理的沉默PRDX2组（shPRDX2+5-Fu），对裸鼠进行腹腔注射，观察裸鼠的生存时间。 5.采用免疫组织化学的方法检测人结肠癌标本中PRDX2和P-AKT的表达情况。对采图结果用Imagepro Plus软件进行分析，对两个指标的结果进行Pearson相关性分析。 6.将HT29细胞分为空载病毒组（shCont）和沉默PRDX2组（shPRDX2），用Western blot检测其中AKT、p-AKT、p-PI3K的蛋白表达量。用AKT信号通路的抑制剂MK-2206处理HT29细胞，采用Western blot检测AKT/PI3K、Bcl-2/Bax、p-AKT、p-PI3K、C-PARP、Caspase-3的蛋白表达情况。进一步用5-FU处理这类细胞后用流式细胞仪检测细胞凋亡率。为了反向验证PRDX2通过AKT/PI3K通路对5-Fu化疗敏感性的影响，我们又构建了过表达PRDX2的慢病毒，转染HT29和HCT116细胞，用Western blot检测AKT/p-AKT和Bcl-2/Bax的蛋白表达。 研究结果： 1.PRDX2-shRNA-LV and NC-shRNA-LV慢病毒转染结肠癌细胞后，空载病毒组（shCont组）PRDX2的蛋白表达及mRNA表达水平均高于沉默PRDX2组（shPRDX2），P＜0.05。 2.经不同浓度5-Fu处理后的结肠癌细胞中，经96孔板细胞计数分析发现空载病毒组（shCont组）细胞的存活率高于沉默PRDX2组（shPRDX2），P＜0.05。 3.经不同浓度5-Fu处理后，流式细胞仪检测发现沉默PRDX2组（shPRDX2）细胞的凋亡率显著上升，同时，凋亡相关蛋白C-PARP和Caspase-3的蛋白表达量均高于空载病毒组（shCont组），P＜0.05。 4.体内试验中，我们经裸鼠腹腔注射了 HCT116-shPRDX2和HCT116-shCont细胞，发现经5-Fu处理的空载病毒组、5-FU处理的沉默PRDX2组以及未经5-Fu处理的沉默PRDX2组比未经5-Fu处理的空载病毒组裸鼠的生存时间长，并且shPRDX2+5-Fu组有最长的生存时间。 5.在50例结肠癌的临床标本中，免疫组华检测发现PRDX2和P-AKT均在结肠癌细胞的细胞质中过表达，通过Pearson相关性分析，发现PRDX2和P-AKT呈明显的线性正相关（r=0.738，P＜0.05）。 6.我们用Western blot检测HT29-shCont组和HT29-shPRDX2组中AKT、p-AKT、p-PI3K的表达，发现下调PRDX2后，p-AKT、p-PI3K的蛋白表达下降。为了反向验证，我们又在HT29和HCT116细胞中构建了过表达PRDX2的细胞系，发现过表达PRDX2后Bcl-2和p-AKT的表达高于对照组。在用了AKT抑制剂MK-2206后，检测发现与没有用MK-2206的细胞组比较，p-AKT、p-PI3K的蛋白表达下降，在5-FU处理后的HT29细胞中，抑制AKT信号通路后C-PARP、Caspase3和Bax的蛋白表达上调而Bcl-2的蛋白表达下降。进一步用流式细胞仪检测发现抑制AKT信号通路后实验组结肠癌细胞的凋亡率较对照组明显升高。 研究结论： 抑制PRDX2的表达可通过AKT/PI3K信号通路促进5-Fu诱导的结肠癌细胞的凋亡。

目录

声明

英汉缩略语名词对照

前言

第一部分 PRDX2 对5-氟尿嘧啶在结肠癌细胞中化疗敏感性的调控作用

引言

1 研究材料

2 方法

3 结果

4 讨论

第二部分 PRDX2调控5-Fu对结肠癌细胞化疗敏感性的机制研究

引言

1 材料

2 实验方法

3 结果

4 讨论

全文总结

文献综述：结肠癌辅助化疗的研究进展

参考文献

致谢

博士期间发表的论文