新型纳米控释骨修复材料抗菌成分释放及治疗慢性骨髓炎的研究

摘要

随着医疗科技设备日新月异的发展，诸多临床疾病的诊疗水平有显著提髙，而慢性骨髓炎的治疗至今仍然是困扰骨外科医生的难题。其表现为多发性合并症、软组织缺损或多重耐药，目前治疗方法不理想，疗程长，复发率髙。金黄色葡萄球菌是最常见的病原体，占人类骨髓炎的80%。由于局部渗透性差和感染部位血液供应不足的缺点，全身性抗生素治疗的疗效受到限制，而长期服用抗生素的副作用显著。局部抗生素治疗可避免诸多药物副作用，并且使抗生素直接作用于感染部位，可有效地清除局部细菌感染。目前临床应用最为广泛的填充材料为抗生素骨水泥（PMMA)，但在长期的治疗过程中许多学者发现并探究其存有明显的缺点，其中重要的一点是PMMA所载抗生素种类受限，携带的抗生素受骨水泥聚合过程放热影响而部分失活，而抗生素的释放曲线并不令人满意，由于突释效应，PMMA在短期内释放大量抗生素，后期抗生素释放总量显著降低，而这种不规则的释放曲线不能良好地满足治疗慢性骨髓炎所需的长时间维持有效的抗生素浓度，一般需超过3-4周。因此，临床上迫切需要寻找一种新型的骨填充材料来替代传统的治疗方式。可吸收材料由于其可降解吸收而不需二次手术取出而成为研究的热点，常用的可吸收材料有硫酸齊、磷酸钙、 生物活性玻璃、脱钙骨基质、胶原植入物等，纳米羟基磷灰石（n-HA)的微观结构与人体骨组织相似，具有很好的生物相容性，但其机械性能不理想，易疲劳破坏。因此，在本研究中，我们添加了聚氨酯（PU)以提髙纳米羟基磷灰石的力学性能。左氧氟沙星具有广谱抗菌性和良好的骨渗透性、对葡萄球菌抗菌活性强、毒性低的优点，已在临床广泛应用。介孔二氧化硅纳米（MSNs)可有效地控制药物的装载和释放，降低药物毒性，提髙疗效，且具有优异的表面性能、孔隙率及良好的生物安全性，非常适合作为骨再生材料。载左氧氟沙星介孔氧化硅微球/纳米轻基磷灰石/聚氨酯（Levofloxacin-loaded mesoporous silica microspheres/nano-hydroxyapatite/polyurethane composite scaffold，Lev@MSNs/n-HA/PU)是一种新型纳米可控释降解复合骨修复材料，前期实验已经证实其具备一定的抗菌及成骨性能，本研究继续建立兔胫骨慢性骨髓炎模型，在体外PBS溶液检测材料抗菌成分释放的特性，并使用抗生素骨水泥作为对照，进一步探讨新型复合材料植入体内后其抗菌性能及骨修复能力，以及是否具有系统毒副作用，并评价其生物力学性能，为该材料临床应用替代抗生素骨水泥提供更详实的实验证据。 本实验由两部分组成 1.Lev@MSNs/n-HA/PU新型复合控释骨修复材料体外抗生素成分释放特性的研究 目的： 检测新型复合骨修复材料Lev@MSNs/n-HA/PU在体外PBS溶液中抗生素成分的释放特征以阐明其抑菌作用机制。 方法： 合成一种新型的载左氧氟沙星介孔氧化硅纳米微球/纳米羟基磷灰石/聚氨酯复合材料，采用高效液相色谱法（HPLC)检测Lev@MSNs/n-HA/PU复合材料浸没于PBS溶液中抗生素在lh，2h,6h,12h,24h及后每2天至第39天的时间点的抗生素浓度，并使用同剂量抗生素的骨水泥作为对照。 结果新型复合材料5mg Lev@MSNs/n-HA/PU在PBS溶液中第一天抗生素释放最快，后释放速率逐渐下降，在第3天、13天及30天等时间点有再次突释的现象，至39天始终保持在金黄色葡萄球菌最小抑菌浓度之上，且释放抗生素总量及缓释能力优于对照组。 结论： 新型复合材料5mg Lev@MSNs/n-HA/PU在PBS溶液中具备良好的缓释性能，其药物释放速率在24h内最快，后逐渐下降，可维持药物有效浓度超过金黄色葡萄球菌MIC至持续释放39天以上，为其植入体内治疗兔慢性骨髓炎发挥有效抑菌作用奠定了夯实的理论基础。 2.Lev@MSNs/n-HA/PU新型复合控释骨修复材料治疗兔胫骨慢性骨髓炎的研究 目的： 使用兔胫骨慢性骨髓炎模型进一步评估新型材料控制感染的能力及骨修复的效果，并评估其远期生物力学安全性，以探究其控释抗菌、骨传导性及生物相容性，为进一步临床实验提供依据。 方法： 体外用扫描电镜（SEM)观察新型材料表观结构。新西兰大白兔45只随机分为四组，根据NOrden1970方法建立兔胫骨慢性骨髓炎模型，清创后实验组植入载5mg左氧氟沙星复合材料（5mgLev@MSNs/n-HA/PU)，对照组分别植入载lmg左氧氟沙星复合材料(1mg Lev@MSNs/n-HA/PU)，载5mg左氧氟沙星聚甲基丙烯酸甲酯(5mgLev@PMMA)，或不处理。治疗前及治疗后监测动物体温、体重、白细胞等指标，于治疗后12周处死动物，采用大体形态学观察、影像学、组织学、骨一材料界面电镜扫描、细菌培养计数及生物力学等方法评价材料修复骨缺损的效果。 结果： 新型复合材料5mgLev@MSNs/n-HA/PU结构疏松多孔，其平均孔隙率为（54.46±5.68)%,孔隙大小为200-500nm，适合骨组织再生。治疗12周后5 mg Lev@MSNs/n-HA/PU组动物体温较治疗前明显下降，体重上升，白细胞数明显下降且对比空白对照组有显著性差异;细菌培养计数示5 mg Lev@MSNs/n-HA/PU组细菌数量较治疗前及空白对照组和1 mg Lev@MSNs/n-HA/PU组显著性减少，证明其抑菌功能显著。X片示5mgMSNs/n-HA/PU组材料降解明显，骨修复良好，无骨质破坏及增生等感染征象，而骨水泥组见材料占位明显。大体病理学示空白对照组骨感染破坏明显，而5mg MSNs/n-HA/PU组骨缺损修复良好，已无死腔存留，大量的新生骨包绕及覆盖材料，而对照组可见材料与骨未形成紧密结合。植入物-骨界面SEM示1 mg Lev@MSNs/n-HA/PU组中见材料一骨界面形成纤维连接及有明显的间隙，5m gLev@PMMA组中未见明显的新生骨形成，交界处界限明显,而5mg Lev@MSNs/n-HA/PU组中材料与骨组织边界线模糊，形成骨性连接，材料的表面也有新骨长入。组织学示5mg Lev@MSNs/n-HA/PU组材料周围界面骨吸收、骨形成活跃，新生骨围绕材料表面及穿过材料的孔隙生长，外周骨修复区已改建形成成熟板状骨，新生骨小梁排列整齐，结构增粗，较致密且连续，其新生骨形成速度及效率优于对照组。生物力学试验结果示5mg Lev@MSNs/n-HA/PU组展现出最髙的腔骨最大抗压缩力，与空白对照组及1mg Lev@MSNs/n-HA/PU组相比差异有统计学意义。 结论： 新型复合骨修复材料5mgLev@MSNs/n-HA/PU植入体内12周可有效治疗兔胫骨慢性骨髓炎，结合彻底清创可显著地控制感染，且其表现出良好的生物相容性、骨传导性及生物力学性能，其兼具缓释抗生素及可控降解骨修复能力，有潜力替代骨水泥成为未来治疗慢性骨感染及修复骨缺损的一种新型骨填充材料。

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