维生素A在先天性肛门直肠畸形肠神经系统发育异常中的作用研究

摘要

第一节维生素A及维甲酸受体RARs在肛门直肠畸形患儿中的表达研究 目的：检测先天性肛门直肠畸形（anorectal malformation，ARM）患儿血清维生素A（vitamin A，VA）水平及肠组织维甲酸受体（retinoic acid receptors，RARs）的表达特点，探究其与ARM患儿肠神经系统(enteric nervous system，ENS）发育异常的联系。 方法：利用高效液相色谱法检测32例初诊ARM新生儿血清VA浓度，选取30例非消化道畸形新生儿血清作为对照；收集30例ARM患儿直肠末端及造瘘口横结肠组织，选取4例非消化道畸形患儿直肠组织作为对照，RT-PCR检测各组肠组织RARα、RARβ、RARγmRNA表达水平；根据患儿直肠末端病检结果将ARM患儿直肠组织分为神经节细胞发育正常组和异常组（n=6/组），免疫组织化学染色和Western blot检测两组直肠RARα蛋白的表达水平。 结果：ARM新生儿血清VA平均浓度显著低于对照组（P＜0.01）；ARM患儿直肠末端RARαmRNA相对表达量显著低于造瘘口横结肠（P＜0.001）和对照组直肠（P＜0.01），而造瘘口横结肠与对照组直肠无显著性差异（P＞0.05）；RARβ、RARγmRNA在各组肠组织间相对表达量无统计学差异（P＞0.05）；RARα蛋白在神经节细胞核及周围的神经纤维呈阳性表达，神经节细胞发育异常组直肠RARα蛋白表达水平显著低于正常组（P＜0.01）。 结论：ARM患儿存在血清VA及直肠组织RARα表达异常，VA及其受体RARα可能参与了患儿ENS的发育过程。 第二节 RARα及NeuN在肛门直肠畸形小鼠模型直肠的表达研究 目的：建立全反式维甲酸（all-trans retinoic acid，ATRA）诱导的小鼠ARM动物模型，筛选最适造模条件；探究ARM小鼠直肠组织RARα和直肠神经元标记物NeuN的表达情况。 方法：C57BL/6J孕鼠随机分为6组，实验组B-D：分别于孕7.5、8.5、9.5d（gestation day，GD）予以100mg/kg ATRA灌胃1次，实验组E-F：分别在GD8.5予以80、60mg/kg ATRA灌胃1次,对照组A孕鼠在GD8.5予以玉米油灌胃1次，所有孕鼠在GD18.5剖宫取出胎鼠。测量胎鼠体重、身长、尾长，分别记录活胎数和伴随畸形数。收集GD16.5-18.5胎鼠直肠组织， RT-PCR和免疫荧光动态检测胎鼠直肠RARα、NeuN表达水平。 结果：各实验组与对照组比较，活胎体重减轻，身长、尾长缩短（P＜0.05），C组胎鼠尾长、身长显著小于D组（P＜0.05），C、E、F组胎鼠体重，身长，尾长均无统计学差异（P＞0.05）。 GD8.5、9.5予以ATRA灌胃均能诱导ARM畸形；以100mg/kg ATRA处理孕鼠，B组胎鼠全部死亡，C组ARM致畸率和死胎率显著高于D组（P＜0.05）。GD8.5予以不同浓度ATRA处理孕鼠，E组ARM致畸率显著高于F组（P＜0.05），与C组无统计学差异（P＞0.05）；E组死胎率显著低于C组（P＜0.05），与F组无统计学差异（P＞0.05）。神经管畸形（neural tube defects，NTDs）总体发生率约为10.59%，与C组相比，D、E、F组NTDs发生率降低（P＜0.05），而D、E、F组间无统计学差异（P＞0.05）。 与同天数对照胎鼠相比，GD16.5-18.5ARM胎鼠直肠RARαmRNA相对表达量均显著降低（P＜0.05）；GD16.5-18.5 ARM胎鼠直肠NeuN mRNA的相对表达量也分别低于同天数对照胎鼠直肠（P＜0.05）。GD16.5-18.5胎鼠直肠均有RARα和NeuN蛋白的阳性表达；RARα阳性染色主要集中在肠肌层区域，和神经元细胞核标记物NeuN的表达部位有重叠；与同天数对照胎鼠直肠相比，ARM胎鼠直肠RARα和NeuN的荧光强度均降低 结论：成功建立了ATRA诱导的C57BL/6J小鼠ARM动物模型， GD8.580mg/kg剂量ATRA灌胃1次为适宜造模条件，致畸率可达95.2%。在ARM模型小鼠中，GD16.5-18.5胎鼠直肠神经元标志物NeuN和RARα表达水平降低，且两者表达部位有重叠，过量的ATRA可能诱导机体负反馈调节导致肠组织RARα水平下调，从而影响ARM小鼠ENS发育的过程。

目录

声明

英汉缩略语名词对照

前言

第一节 维生素A及维甲酸受体RARs在肛门直肠畸形患儿中的表达研究

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

4 结论

第二节 RARα及NeuN在肛门直肠畸形小鼠模型直肠的表达研究

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

4 结论

参考文献

全文总结

文献综述:先天性肛门直肠畸形病因及与维生素A相关研究概述

致谢

硕士期间发表论文