DNA甲基化在癲痫发生中的作用研究

摘要

第一部分：癱痫发生相关基因的生物信息学分析 目的：癫痫发生是一个复杂的病理生理学变化过程，从基因组水平筛选并分析与癫痫发生有关的功能基因是研究该疾病的一种主要途径。本部分拟利用美国国家生物信息中心（National Centerfor Biotechnology Information,NCBI)数据库中的芯片数据对癫痫发生进程中持续性差异表达基因进行筛选和分析，从而为探索癫痫发生机制提供参考依据。 方法：我们从NCBI基因芯片数据库（GEODataSets)中获得GSE73878芯片数据，运用GE02R在线分析软件对海人酸(Kainicacid,KA)诱导癫痫持续状态（Statusepilepticus，SE)小鼠（KA小鼠）第7天、28天和60天的海马表达谱数据与正常小鼠海马的表达谱数据进行比较，寻找出KA小鼠癫痫发生进程中持续性差异表达的基因。最后，我们将这些持续性差异表达的基因导入在线分析工具DAVID6.7中进行GO功能富集分析及KEGGPathway富集分析。 结果：在癫痫发生进程中，KA小鼠的海马共有113个持续表达上调的基因，但仅有6个持续表达下调的基因（FgflO、GdflO、Cadps2、Secl411、RASgrfl)o持续表达上调基因的Go功能富集分析和KEGGPathway富集分析显示，这些上调基因主要参与炎症反应过程。 结论：基因芯片数据分析筛选出的持续性差异表达基因可能和癫痫密切相关，并可能成为癫痫发生进程中的潜在关键基因，但这仍需要进一步实验证实。 第二部分：RASgrfl启动子区甲基化对癲痫发生影响的初探 目的：DNA甲基化与癫痫密切相关。基因启动子区高甲基化是抑制基因表达的一种重要调控方式。本文第一部分研究发现的可能与癫痫发生有关的6个持续低表达基因中，RASgrfl的启动子区含有沉默基因座的特异性甲基化区域（differentially methylated region，DMR)。因此，本部分拟探索在潜伏期用甲基化转移酶（(DNA methyctransferace,DNMTs)抑制剂Rgl08干预小鼠癫痫发生进程，能否抑制小鼠自发反复痫性发作（spontaneous recurrent seizures,SRS)的形成；以及RASgrfl是否可能是DNA甲基化在癫痫发生进程中调控的潜在关键基因。 方法：我们给予成年雄性C57BL/6小鼠腹腔内注射KA(15mg/Kg)诱导SE，并在潜伏期经侧脑室分别给予不同分组小鼠Rgl08+DMSO、NS+DMSO,最后在慢性期观察各组小鼠的行为学变化和脑电变化。然后，我们根据慢性行为学结果，将实验小鼠分成5个亚组[con组（未造模小鼠）、RG108-SRS组（RG108组中形成SRS的小鼠）、RG108-NSRS组（RG108组中未形成SRS的小鼠）、NS-SRS组（NS组中形成SRS的小鼠）、RG108-NSRS组（NS组中未形成SRS的小鼠）]，运用BSP、PCR、Westernblot技术检测不同亚组小鼠海马组织中RASgrfl启动子区DNA甲基化水平和RASgrfl基因的表达(mRNA、蛋白质）水平。 结果：与NS组（侧脑室注射NS+DMSO)相比，Rgl08组（侧脑室注射Rgl08+DMS〇)中小鼠的SRS发生率明显降低(Rgl08组vs.NS组：66.7%vs.25.0%),且差异具有统计学意义（P＜0.05)。同时，研究发现，Rgl08组中小鼠SRS的发作频率（4.67±1.53次/周）与NS组中小鼠SRS的发作频率（5.38±1.69次/周)没有显著统计学差异（P＞0.05)。我们研究还发现，RG108-SRS组和NS-SRS组小鼠海马区RASgrfl启动子区DNA甲基化水平明显高于con组、RG108-NSRS组、NS-NSRS(P＜0.05)，而其对应的mRNA和蛋白质表达量明显降低（P＜0.05);同con组比较，RG108-NSRS组与NS-NSRS组RASgrfl启动子区DNA甲基化水平、mRNA、蛋白表达量均没有明显差异。 结论：在癫痫发生发展过程中，基因组DNA甲基化水平可能与慢性癫痫形成密切相关，RG108可以改变KA小鼠癫痫发生的进程并预防慢性癫痫。RASgrfl可能是DNA甲基化在癫痫发生进程中调控的潜在关键基因。

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