一种低密度脂蛋白选择性吸附剂的制备及其性能研究

摘要

心脑血管疾病是威胁人类身体健康和生命的主要疾病，动脉粥样硬化是导致心脑血管疾病发生发展的重要因素，而医学研究和临床实践已证实血液中低密度脂蛋白(LDL)的异常升高是导致动脉粥样硬化发生发展和恶化的重要的独立的危险因素，且降低血液中LDL的水平可以降低心脑血管疾病发生的几率。 临床上降低血液中低密度脂蛋白的水平的疗法有药物疗法、饮食控制疗法和血液净化疗法。临床文献报道当病人的LDL的水平超过了300 mg/dL(生理正常参考值为≤120 mg/dL)或者家族性高脂血症患者(FH)，对这种情形下目前采用血液净化疗法对其进行治疗时所取得的效果是上述三种方法中综合效果最好的。高脂血症的血液净化疗法是将患者血液经由医用管路引到体外后，以物理或化学的方式对血液或血浆进行或吸附，或分离，或过滤，或置换等处理，使血液/血浆中的致病物质(这里主要针对的是 LDL)被清除掉而快速地降低至生理安全值范围，从而达到快速降脂并为后续的药物和饮食控制疗法赢得时间和创造便利的条件实现对疾病的预防和治疗的目的。血脂净化疗法的关键是 LDL 的分离技术，血脂净化材料则是隶属于此关键分离技术范畴。目前血脂净化疗法中综合性能最为优秀的是德国人发明的“肝素诱导沉淀法”即“HELP”法，其是基于血浆．肝素缓冲混合液在PH=5.12下形成“LDL-纤维蛋白原-肝素”复合沉淀物后而将其滤过去除的原理来实现对 LDL 的快速清除的。但此法由于采用的是游离的肝素，会存在因肝素(临床上长期使用的一种优良的医用抗凝剂)的过量使用而使病人因不凝血而由此出现出血性危险的不安全因素的可能。本研究在综合国内外现有血脂净化材料的优缺点的基础上，拟新设计和研制一种 LDL 选择性吸附剂，要使其避免上述“HELP”法中的不足，同时在性能上拟要达到安全、有效、实用，并且在生产上要相对简单容易且成本相对低廉、可推广性和可普及性相对较高等目标。 本文利用LDL分子呈正电性(其分子中的B100结构中含有特有的呈正点性的赖氨酸和精氨酸)，配基肝素分子呈强负电性(其分子中含有丰富的呈强负电性的磺酸基，以及羧基和羟基)，二者能够通过静电作用进行特异性亲和结合的原理，独特地将配基肝素以共价键(保证了稳定性)的方式借助双官能团连接剂(戊二醛)的帮助下通过固．液非均相分两步合成法将其固载到载体(聚乙烯醇，PVA-1799，FDA批准的药用辅料，生物相容性好，表面官能基团丰富且唯一以利于表面改性)固体表面上而拟制得该目标LDL选择性吸附剂。 本研究考察了配基肝素固载到载体表面上去的固定化工艺参数(如物料比、反应时间、催化剂用量等)对配基肝素固定量的影响情况，考察结果是当载体PVA-1799颗粒(以克为单位)与双官能团连接剂(50％的戊二醛水溶液，以mL为单位)的物料比为1:3时，且在78℃的回流温度下反应约 5h，浓盐酸催化剂的用量约为50％戊二醛水溶液用量的1％左右时，能够获得较高的配基固定量；对所制得的LDL选择性吸附剂通过IR红外表征和XPS表面分析技术表明此技术能够成功地将配基肝素以共价键的方式固载到载体表面上；通过含量测定结果表明本技术可使每克载体的表面上约固载18～25μg的配基肝素；所研制得的LDL选择性吸附剂在弱碱性(PH7.2～9.5)环境下对LDL具有较高的选择性吸附效力；当4份稀释血浆(2份人原高脂血浆+2份缓冲稀释液，以mL为单位)与1份吸附剂(以g为单位)在动态循环2～4 h 的接触吸附滤过过程中，该吸附剂对LDL的选择性吸附清除效率在60％左右，表明所研制的吸附剂是较有效的，达到了项目合同中的预期研制目标(40％～80％)的要求。此外，本吸附剂对血液的相关成分的影响中，其负影响的程度有的可以忽略，有的在临床上在可以接受的范围。按《医疗器械生物学评价国家标准》中的相关标准和规定对所研制的 LDL 选择性吸附剂的安全性进行了初步评价考察，主要评价了其细胞毒性试验、急性全身毒性试验、体内过敏试验、热源试验、内毒素试验、溶血试验、凝血试验、血小板粘附试验、血常规分析试验、补体试验、酶学系统试验、无机离子指标试验、初步的动物试验等，这些试验的初步结果表明本吸附剂是安全可用的。 本研究还对载体(国产聚乙烯醇-1799)固体表面的羟基数量进行了初步的测定，从测定的初步结果发现，其表面上可用于表面改性修饰的活性官能团羟基的数量很低，约在10<'-7>mol/cm<'2>数量级，故从本质上来说，表面修饰率是低的。 本研究还对不同的LDL选择性吸附剂的制备工艺进行了对照考察，结果表明配基肝素被固定化到载体上后，其空间自由度的高低不仅影响其抗凝性能，同时也影响其对LDL的选择性吸附效力，即空间自由度较高，其选择性吸附LDL的效力也较高。 结论：本文所研制的LDL选择性吸附剂对LDL具有较高的吸附效率，在指定的条件下其效率约在60％，且初步的评价结果表明其是安全有效的，另外其制备的技术路线相对较简单容易实现且预期成本相对较低，达到了本项目开发的预期目标。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：主要缩略词

声明

1绪论

1.1本章提要

1.2概述

1.3血液净化

1.3.1血液净化概述

1.3.2血液透析

1.3.3血液滤过

1.3.4血液灌流

1.3.5血桨交换

1.3.6腹膜透析

1.3.7血液净化技术新发展

1.4肝素固定化

1.4.1肝素固定化概述

1.4.2肝素固定化的技术原理与途径

1.4.3肝素固定化的手段

1.4.4肝素固定化的应用

1.4.5肝素固定化技术的发展前景

1.5低密度脂蛋白分离技术

1.5.1概述

1.5.2常规双重滤过

1.5.3加热双重滤过

1.5.4硫酸右旋糖酐纤维素吸附法

1.5.5肝素体外LDL沉淀法

1.5.6 LDL的血液灌流分离技术

1.5.7免疫吸附

1.5.8血脂净化治疗的临床疗效

1.5.9 LDL分离技术展望

1.6低密度脂蛋白吸附剂

1.6.1 LDL免疫吸附类

1.6.2 LDL阴离子型吸附剂类

1.6.3非离子型LDL吸附剂类

1.7课题设计

1.7.1课题设计的思想

1.7.2课题所涉及的研究内容

1.7.3本课题的特色

1.8本章小结

2载体聚乙烯醇表面羟基数量的初步测定研究

2.1本章提要

2.2引言

2.3材料与方法

2.3.1主要仪器和试剂

2.3.2 PVA膜的制作

2.3.3试剂配制

2.3.4酰化法测羟基含量

2.3.5酯化法测羟基含量

2.3.6 XPS分析

2.4结果与分析

2.4.1酰化法结果

2.4.2酯化法结果

2.4.3 XPS分析结果

2.4.4分析讨论

2.5本章小结

3固定化配基肝素含量测定方法的建立研究

3.1本章提要

3.2引言

3.3材料与方法

3.3.1主要仪器和试剂

3.3.2分析步骤

3.3.3结果与分析

3.3.4分析讨论

3.4本章小结

4 LDL选择性吸附剂的制备研究

4.1本章提要

4.2概述

4.3材料与方法

4.3.1主要仪器和试剂

4.3.2 LDL选择性吸附剂制备工艺

4.3.3对目标吸附剂的红外分析

4.3.4对目标吸附剂的XPS表面分析

4.3.5对目标吸附剂的配基固定量分析

4.3.6对目标吸附剂的固定化肝素动态稳定性考察

4.3.7目标吸附剂的吸水性考察

4.3.8目标吸附剂的表面形貌观察

4.4结果与讨论

4.4.1红外表征结果

4.4.2 XPS表征结果

4.4.3 PVA与50％戊二醛水溶液物料比对配基固定量的影响

4.4.4反应时间对配基固定量的影响

4.4.5催化剂用量对配基固定量的影响

4.4.6次反应时间对配基固定量的影响

4.4.7次反应温度对配基固定量影响

4.4.8配基固定化稳定性考察

4.4.9目标吸附剂的吸水性能考察

4.4.10目标吸附剂的表面形貌观察结果

4.5本章小结

5吸附剂对LDL的吸附效能评价研究

5.1本章提要

5.2概述

5.3材料与方法

5.3.1主要仪器和试剂

5.3.2对LDL吸附效率的考察

5.4结果与分析

5.4.1稀释体系对LDL的静态吸咐效率的影响

5.4.2接触时间对LDL的静态吸咐效率的影响

5.4.3接触时间对LDL的动态吸咐效率的影响

5.5本章小结

6 LDL选择性吸附剂的安全性评价

6.1本章提要

6.2概述

6.3细胞毒性试验

6.3.1细胞毒性试验概述

6.3.2材料与方法

6.3.3评价结果

6.4急性全身毒性试验

6.4.1急性全身毒性试验概述

6.4.2主要仪器和试剂

6.4.3试验步骤

6.4.4试验结果

6.5体内过敏试验

6.5.1主要仪器和试剂

6.5.2试验步骤

6.5.3试验结果

6.6热原试验

6.6.1热原试验概述

6.6.2主要仪器和试剂

6.6.3试验步骤

6.6.4检验结果

6.7内毒素试验

6.7.1主要仪器和试剂

6.7.2检验

6.7.3内毒素检验结果

6.8溶血试验

6.8.1主要仪器和试剂

6.8.2实验步骤

6.8.3试验结果

6.9凝血试验

6.9.1主要仪器和试剂

6.9.2试验步骤

6.9.3检验结果

6.10血常规分析试验

6.10.1主要仪器和试剂

6.10.2试验步骤

6.10.3检测结果

6.10.4统计分析结果

6.11补体试验

6.11.1主要仪器及试剂

6.11.2实验方法

6.11.3结果

6.12血小板粘附试验

6.12.1主要仪器和试剂

6.12.2试验步骤

6.12.3试验结果

6.13吸附前后酶学系统的监测

6.13.1酶学系统监测概述

6.13.2材料与方法

6.13.3方法

6.13.4结果

6.14吸附前后肾功能的监测

6.14.1肾功能监测概述

6.14.2材料与方法

6.14.3方法

6.14.4结果

6.15吸附前后无机离子的监测

6.15.1无机离子监测概述

6.15.2材料与方法

6.15.3方法

6.15.4结果

6.16初步的动物试验

6.16.1主要仪器和试剂

6.16.2实验过程

6.16.3实验结果

6.17本章小结

7 LDL选择性吸附剂的制备工艺对照研究

7.1本章提要

7.2引言

7.3材料与方法

7.3.1主要仪器和试剂

7.3.2制备工艺

7.4结果与分析

7.4.1制备原理

7.4.2配基肝素的固定量

7.4.3对LDL的静态吸咐效率

7.4.4讨论

8主要结论和后续工作建议

8.1主要结论

8.2后续工作建议

致 谢

参考文献

附 录