贡嘎蝠蛾幼虫肠道细菌多样性分析

摘要

冬虫夏草是是我国特产传统珍稀名贵中药材，是具有重大药用和保健功能的生物资源。冬虫夏草天然资源稀少，分布范围狭窄，自身生长发育缓慢，其寄主昆虫蝠蛾幼虫成活率低，加上近年来全球气候变化、虫草滋生生态环境恶化，以及人们的掠夺式采挖，冬虫夏草已经处于自然资源日益枯竭的状态。昆虫肠道微生物菌群对于宿主的生理和病理都有重要影响。本研究利用传统分离培养方法和分子生物学方法，对四川康定地区优势冬虫夏草寄主—贡嘎蝠蛾（Hepialus gonggaensis，Hg）在实验室养殖条件下幼虫肠道微生物群落的多样性和优势菌群进行了较为系统的研究，以期找出影响规模化饲养蝠蛾幼虫饲养的关键因素，为解决规模化养殖过程中生长发育不良、幼虫成活率低的难题提供理论基础和技术支撑。
　　主要研究结果如下：
　　①从幼虫肠道中，通过常规分离培养的方法获得的菌群进行形态观察、培养特征、生理生化鉴定以及以16S rRNA分析方法对细菌类群进行了鉴定，分离的细菌类群归为8个属，其中肠杆菌属（Enterobacter）是优势菌群，肉食杆菌属（Carnobacterium）是次优势菌群。分离菌群中的肉杆菌属（Carnobacterium）一菌株对幼虫的有促生长的作用，不动杆菌属（Acinetobacter sp.）细菌对常见的鳞翅目常见的病原细菌、病原真菌的生长有抑制作用。
　　②基于细菌16S rRNA作为分子标记的变性梯度凝胶电泳（Denaturing Gradient Gel Electrophoresis，DGGE）的方法，对幼虫肠道中细菌菌群进行了分析。直接提取蝠蛾肠道总DNA，经PCR扩增和切胶测序分析得到11条优势DGGE条带序列，与GenBank中数据进行了比对和系统进化树分析，得到8个属的细菌类群，其中肉食杆菌属（Carnobacterium）的丰度最高，是肠道细菌中主要的优势菌群，芽孢杆菌属（Bacillus）是次优势菌群。DGGE图谱还显示 Hg幼虫不同虫龄肠道细菌菌群的结构存在差异，推测可能与其发育生理状态有关系。
　　③常规分离培养法与基于16S rDNA序列分析分别获得8个不完全相同的细菌属种，优势菌群也不完全相同。
　　④利用近年报道的主要用于分子生物学中基因文库构建的均一化技术对肠道微生物区系进行了研究。根据大肠杆菌16S rRNA基因保守序列设计的引物对贡嘎蝠蛾幼虫肠道基因组DNA进行PCR扩增，经过均一化酶作用后构建的均一化贡嘎蝠蛾幼虫肠道微生物16S rDNA基因文库所得到的100个克隆，经过三种限制性内切酶 RsaⅠ、MspⅠ和HaeⅢ消化后产生86个不同的片断长度多态性（restriction fragment length polymorphism）图谱，随机选择47个克隆测序，与GenBank中的数据比较并进行系统进化树分析可知，文库中共得到5个门（Proteobacteria，Firmicutes，Actinobacteria，Bacteroidetes and Planctomycetes）13个科（Rhizobiaceae，Microbacteriaceae，Spiroplasmataceae，Enterobacteriaceae，Micrococcaceae，Flavobacteriaceae，Comamonadaceae，Planctomycetaceae，Oxalobacteraceae，Pseudomonadaceae，Flexibacteraceae，Carnobacteriaceae，Sphingomonadaceae）共16个属的微生物类群，另外均一化文库还得到15个未命名的不可培养的微生物。在文库中占最高比例的克隆分别属于Carnobacterium sp.和Spiroplasma sp.，在文库中的比例分别是13％和12%，它们是幼虫肠道中的优势细菌。
　　⑤均一化的16S rDNA文库所得到的细菌菌群和常规分离培养和通过基于16S rDNA标记的DGGE技术所获得的菌群有相似之处，但是前者所揭示的多样性却比后两者多。结合多种方法可以更有效的分析肠道微生物的多样性，获得更多更全面的微生物多样性信息。

目录

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中文摘要

英文摘要

目录

1 绪 论

1.1研究背景和意义

1.2 立论依据

1.3昆虫肠道微生物的研究进展

1.4 肠道微生物研究方法介绍

1.5均一化技术的研究进展

1.6 16S rDNA分析的PCR－DGGE介绍

1.7 研究内容与技术路线

1.8 创新之处

2 贡嘎蝠蛾幼虫肠道可培养微生物与优势菌群分析

2.1材料和方法

2.2 结果

2.3 本章小结

3 贡嘎蝠蛾幼虫肠道菌群多样性的均一化文库的构建

3.1 材料与方法

3.2结果与分析

3.3 本章小结

4 贡嘎蝠蛾幼虫肠道菌群多样性的16S rDNA的PCR-DGGE法研究

4.1 材料与方法

4.3 本章小结

5 总结与讨论

5.1 贡嘎蝠蛾幼虫肠道中微生物多样性及功能

5.2 基于DSN的均一化文库构建技术对微生物多样性的揭示

5.3各种分析方法的评价

6 后续工作

致谢

参考文献

附录