药用植物荞麦内生真菌的分离鉴定及其抗菌抗肿瘤活性研究

摘要

植物内生真菌是指在其整个生活史或者生活史的某一阶段生活在植物组织体内的一类并不引起明显病害症状的真菌。它们有着丰富多样的具有重要生物学活性的代谢产物，从植物中分离获得能够产生活性物质的内生真菌菌株有着重要的意义，同时也是目前微生物药物研发的一个热点。
　　 金荞麦(Fagopyrum dibotrys)和苦荞麦(Fagopyrum tataricum)都是蓼科(Polygonaceae)荞麦属(Fagopyrum)植物，研究表明金荞苦荞植物提取物有抑菌、抗肿瘤、抗氧化、降血糖、降血脂等药理活性。目前我国对荞麦的研究多集中在植物化学成分分析，尚未见到对其内生真菌的研究报道。
　　 本研究从金荞麦和苦荞麦的根、茎、叶、花中分离到62株内生真菌，采用K-B纸片法和细胞毒筛选模型(MTT法)分别对这些内生真菌发酵液的抗菌和抗肿瘤活性进行了测定。结果表明，有三株内生真菌的发酵液对大肠杆菌、黄瓜枯萎病菌等和人肝癌细胞株HepG2细胞生长有明显的抑制作用。对分离自苦荞花的内生真菌KQH-01和KQH-02的醇提物诱导HepG2细胞凋亡进行了荧光染色、DNAladder和流式细胞(FCM)分析显示，内生真菌KQH-01和KQH-02次生代谢醇提物能诱导HepG2细胞凋亡。
　　 以ITS1和ITS4为引物，对活性菌株KQH-01、KQH-02和JQY-1的ITS序列进行了PCR扩增，并对扩增产物进行了测序，序列比对分析发现KQH-02为毛壳属(Chaetomium sp.)的球毛壳菌；JQY-1为葡萄座腔菌Botryosphaeria sp.)；而KQH-01的ITS序列与数据库中已知种类序列的同源性仅为94％，所以KQH-01可能是炭角菌属的一个新种或亚种，该序列已在GenBank中登录(Accession No.：FJ170815)。
　　 对抑菌和抗肿瘤活性较高的KQH-02的次生代谢产物成分进行了初步的分析，GC-MS分析结果表明其乙醇提取物的甲醇提取成分主要有正十六酸(n-hexadecanoic acid)、十八烷酸(octadecanoic acid)、油酸(oleic acid)和棕榈油酸(hexadecenoic acid)等。KQH-01和KQH-02的次生代谢产物经HPLC分析得到了一个组分槲皮素(quercetin)。这为进一步的研究和开发内生真菌的生物活性物质打下了基础。

目录

文摘

英文文摘

声明

1绪论

1.1内生真菌的研究概况

1.1.1内生真菌的发展

1.1.2筛选活性内生真菌的理论基础

1.1.3内生真菌的多样性及其活性物质

1.2金荞和苦荞研究现状

1.2.1金荞和苦荞的生物学特性

1.2.2金荞和苦荞的药理活性及化学成分

1.3本研究的目的意义

1.4本研究的创新点

1.5技术路线

2内生真菌的分离和纯化

2.1材料

2.1.1植物内生真菌分离材料

2.1.2主要试剂

2.1.3分离和纯化培养基

2.1.4主要仪器设备

2.2方法

2.2.1植物材料的处理

2.2.2内生真菌分离与纯化

2.2.3内生真菌的纯化

2.2.4材料表面消毒效果检查

2.2.5内生真菌的保存

2.3结果与分析

2.3.1内生真菌的分离结果

2.4本章小结

3内生真菌的抗菌活性

3.1材料

3.1.1实验菌株

3.1.2培养基

3.1.3主要仪器

3.2方法

3.2.1内生真菌液体培养及发酵液处理

3.2.2内生菌的抗菌活性测定

3.3结果与分析

3.3.1具有抗菌活性内生真菌的筛选

3.3.2具抗菌活性内生真菌的抗菌效果

3.3.3最低抑菌浓度(MIC)的测定

3.4本章小结

4内生真菌的抗肿瘤活性

4.1材料

4.1.1实验菌株和细胞株

4.1.2主要试剂

4.1.3主要器材

4.2方法

4.2.1内生真菌液体培养及发酵液处理

4.2.2抗肿瘤活性测定

4.2.3苦养内生真菌发酵产物EE-02／EE-01诱导HepG2细胞凋亡

4.3结果与分析

4.3.1具有抗肿瘤活性内生真菌

4.3.2 EE-02诱导的HepG2细胞凋亡

4.4本章小结

5活性菌株的形态及分子鉴定

5.1材料

5.1.1菌株来源

5.1.2培养基

5.1.3主要试剂

5.1.4主要器材

5.2方法

5.2.1三株活性菌株的形态观察

5.2.2 ITS序列的PCR扩增及测序

5.3结果与分析

5.3.1三株活性菌株的形态特征

5.3.2三株内生真菌的分子鉴定

5.3.3活性菌株的系统发育分析

5.4本章小结

6活性菌株次生代谢产物成分初步分析

6.1材料

6.1.1内生真菌次生代谢产物

6.1.2培养基

6.1.3主要试剂及仪器

6.2方法

6.2.1样品处理

6.2.2 GC-MS测试分析

6.2.3 HPLC分析

6.3结果与分析

6.3.1 EE-02的GC-MS分析

6.3.2 HPLC分析

6.4本章小结

7结论与展望

7.1本研究的结论

7.2本研究展望

致 谢

参考文献

附录 攻读硕士期间发表的论文