MKL1在巨核细胞分化过程中的表达及其对巨核细胞多倍体化的影响

摘要

急性巨核细胞白血病(Acute Megakaryoblastic Leukemia,AMKL)，在急性髓系白血病(acute myeloid leukemia,AML)分型中也称为M7，至少同唐氏综合症(Down's syndrome，DS)和t(1；22)(p13；q13)染色体易位两类染色体异常有关，伴有骨髓中原始巨核细胞(megakaryoblast)增加、骨髓纤维化和血小板减少等症状。t(1；22)(p13；q13)是AMKL特有的遗传特征，在1号和22号染色体上形成了RBM15(RNA-binding motif protein15，RBM15)和MKL1(megakaryoblastic leukemia-1，MKL1)的融合基因。目前人们对于RBM15-MKL1融合蛋白在AMKL致病中发挥的作用所知有限，充分认识RBM15和MKL1正常情况下在造血系统中的功能特点有助于了解RBM15-MKL1融合蛋白在AMKL形成、发展中的作用。目前，关于MKL1在巨核细胞发育中的功能尚未见报道。
　　 本实验组之前的研究发现在人红白细胞白血病细胞(human erythroleukemiacells，HEL)中表达外源MKL1显著增加了TPA(12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate)刺激下巨核细胞的分化以及多倍体化。为了进一步研究MKL1在造血系统巨核细胞生成(megakaryopoiesis)中的作用，本文以动员人外周血CD34+细胞(mobilizedhuman peripheral blood CD34+cells，PB CD34+cells)巨核细胞分化为研究对象，利用实时定量PCR考察MKL1基因在巨核细胞分化过程中的表达情况；通过慢病毒载体在PB CD34+细胞中表达MKL1，考察外源MKL1对PB CD34+细胞来源巨核细胞分化、成熟的影响；最后通过构建MKL1基因敲除小鼠模型，研究MKL1功能缺陷对小鼠外周血血小板数量和骨髓中巨核细胞生成的影响。
　　 主要研究工作和结果如下：
　　 ①动员人外周血CD34+细胞来源巨核细胞体外两阶段分化模型的建立
　　 建立并优化了动员人外周血CD34+细胞体外分化为巨核细胞的两阶段培养条件：采用自制的Cocktail培养液和Stem Cell Technologies公司购买的CC100培养液刺激细胞增殖3天、4天、5天或6天，然后转入含有TPO(thrombopoietin)和SCF(stem cell factor)的分化培养液培养7天、8天或9天，培养结束后通过比较CD41+细胞和多倍体细胞相对初始CD34+细胞的倍增情况，优化培养条件。实验结果表明在本研究范围内，PB CD34+细胞在Cocktail培养液中扩增3天后转入分化培养液培养7天，细胞能获得16倍数量的CD41+细胞和3倍数量的多倍体巨核细胞，优于其它实验组。同时，该实验结果在CD41+细胞和多倍体细胞产量上优于目前常用的单阶段法体外PB CD34+细胞来源巨核细胞分化条件，可以为巨核细胞相关的体外研究提供大量的实验细胞来源。
　　 ②MKL1基因在巨核细胞分化中的表达
　　 利用流式细胞仪和BSA非连续梯度法分离了不同成熟阶段的巨核细胞，实时定量RT-PCR研究MKL1在不同成熟阶段巨核细胞中的表达情况：1.5％BSA组(含67.2％CD41+细胞，1.3％多倍体巨核细胞)、3％BSA组(含74.4％CD41+细胞，39.3％多倍体巨核细胞)和流式分选细胞组(含98.0％CD41+细胞，21.5％多倍体巨核细胞)相对于对照组PB CD34+组(CD41+细胞和多倍体细胞含量均为0％)MKL1基因表达量的平均变化分别为3.0、6.8和5.0倍，均显著高于PB CD34+组(p＜0.01)。此外，MKL1表达量流式分选组显著高于1.5％BSA组(p＜0.01)，3％BSA组显著高于流式分选组，提示MKL1基因在CD41+细胞中的表达量高于未分化的PB CD34+细胞，在成熟多倍体巨核细胞中的表达量高于单核巨核细胞，即随着CD34+细胞来源巨核细胞的分化和成熟，MKL1表达逐渐升高。
　　 ③MKL1外源表达对PB CD34+细胞来源巨核细胞生成的影响
　　 利用慢病毒载体在PB CD34+细胞中表达外源MKL1，MKL1过表达的pCCL-MKL1组经两阶段法诱导分化后CD41+巨核细胞的比例为61.49％，显著高于pCCL对照组36.26％的分化比例(p＜0.05)。在DNA分布方面，pCCL-MKL1组相对pCCL组，2N倍体细胞比例由35.46％降低为23.86％(p=0.013)，4N倍体细胞比例由30.52％降低为21.52％(p=0.001)，16N倍体细胞比例由9.15％增加为19.44％(p=0.014)，32N倍体细胞比例由2.39％增加为7.77％(p=0.010)，多倍体细胞(8N及以上倍体)总比例由31.10％增加为50.81％(p=0.001)。因此，MKL1外源表达促进了PB CD34+细胞来源巨核细胞分化，增加了巨核细胞中多倍体细胞比例，促进了巨核细胞的成熟。
　　 ④MKL1功能缺陷对小鼠巨核细胞生成的影响
　　 构建MKL1基因敲除小鼠，通过外周血和骨髓细胞的研究发现，MKL1功能缺陷小鼠外周血中的红细胞、白细胞数量同野生型小鼠没有差异，血小板数量为5.2×105/μL显著低于野生型对照组8.2×105/μL(p＜0.001)，表现为血小板生成障碍；MKL1基因敲除小鼠骨髓细胞总数、LSK细胞(Lin-Sca-1+c-Kit+cells，LSK cells)比例、pre-MegE(erythro-megakaryocytic progenitor cells，pre-MegE)细胞比例和巨核细胞集落形成能力与野生型小鼠没有显著差异；CD41+细胞比例显著高于对照组(p＜0.0001)，CD41+c-kit+巨核系祖细胞比例也显著高于野生型对照组(p＜0.01)；在DNA分布方面，MKL1基因敲除小鼠的骨髓CD41+细胞中，2N倍体细胞比例为32.15％显著高于野生型小鼠14.97％的比例(p＜0.001)；同时8N和16N倍体细胞比例MKL1 KO组为18.20％和19.67％，显著低于野生型对照组25.90％(p＜0.01)和30.65％(p＜0.05)的比例。因此，MKL1功能缺陷并未影响造血干/祖细胞到巨核细胞分化的早期过程，但阻滞了巨核系祖细胞或早期巨核细胞向多倍体巨核细胞的发育成熟过程，导致大量的未成熟的巨核细胞在骨髓中的堆积；而巨核细胞的成熟功能缺陷也直接导致了在外周血中血小板数量的减少。
　　 综合以上结论我们推测，MKL1直接或通过与其它蛋白共同作用参与了巨核细胞成熟过程的调控，RBM15-MKL1融合蛋白可能导致了MKL1指导巨核细胞多倍体化功能的丧失，这可能是t(1；22)(p13；q13)AMKL形成的原因。

目录

文摘

英文文摘

声明

1 绪论

1.1问题的提出及研究意义

1.1.1问题的提出

1.1.2研究的意义

1.2国内外研究现状

1.2.1造血和造血干细胞(hematopoietic stem cell,HSC)

1.2.2巨核细胞生成

1.2.3动员人外周血CD34+细胞

1.2.4 RBM15

1.2.5 MKL1

1.2.6 RBM15-MKL1

1.3本文研究的目的和研究内容

2巨核细胞体外两阶段分化模型的建立

2.1引言

2.2实验材料

2.2.1实验细胞

2.2.2主要仪器设备及耗材

2.2.3主要实验试剂

2.2.4主要试剂的配制

2.3实验方法

2.3.1动员人外周血CD34+细胞收集

2.3.2细胞培养

2.3.3血细胞涂片

2.3.4流式细胞仪检测

2.4实验结果

2.4.1动员人外周血CD34+细胞收集

2.4.2 PB CD34+细胞在Cocktail和CC100培养液中的增殖情况

2.4.3 CC100两阶段法培养条件的优化

2.4.4 Cocktail两阶段法培养条件的优化

2.4.5细胞形态

2.4.6优化后条件与常用方法分化效率的比较

2.5分析讨论

2.6本章小结

3 MKL1基因在巨核细胞分化中的表达

3.1引言

3.2实验材料

3.2.1主要仪器设备及耗材

3.2.2主要实验试剂

3.3实验方法

3.3.1不同成熟阶段CD41+细胞培养、收集

3.3.2 RNA提取、纯化和反转录

3.3.3 qPCR检测基因表达

3.4实验结果

3.4.1不同成熟阶段细胞分选

3.4.2 MKL1基因表达情况

3.4.3 GATA1和NF-E2基因表达情况

3.5分析讨论

3.5.1细胞分选方法

3.5.2分选细胞的成熟程度

3.5.3 MKL1基因表达

3.6本章小结

4 MKL1外源表达对巨核细胞生成的影响

4.1引言

4.2实验材料

4.2.1主要仪器设备及耗材

4.2.2主要实验试剂

4.2.3主要试剂的配制

4.3实验方法

4.3.1慢病毒载体的构建、包装

4.3.2慢病毒感染PB CD34+细胞

4.3.3Western Blot

4.3.4流式细胞仪检测

4.4实验结果

4.4.1慢病毒滴度

4.4.2目的基因在被感染细胞中的表达情况

4.4.3外源MKL1表达对巨核细胞分化和成熟的影响

4.5分析讨论

4.5.1慢病毒载体的构建

4.5.2外源MKL1表达对PB CD34+来源巨核细胞生成的影响

4.5.3 MKL1与其它细胞的多倍体化

4.6本章小结

5 MKL1基因敲除对小鼠巨核细胞生成的影响

5.1引言

5.2实验材料

5.2.1实验动物

5.2.2主要仪器设备及耗材

5.2.3主要实验试剂

5.3实验方法

5.3.1 MKL1基因敲除小鼠模型的构建

5.3.2小鼠基因型鉴定

5.3.3骨髓细胞的分离

5.3.4外周血细胞计数

5.4实验结果

5.4.1外周血细胞计数

5.4.2MKL1基因敲除对骨髓中巨核细胞生成的影响

5.5分析讨论

5.6本章小结

6结论与展望

6.1主要结论

6.2后续工作展望

6.2.1 MKL1调控巨核细胞成熟的机理

6.2.2 RBM15-MKL1融合蛋白功能研究

6.2.3MKL1是否对其它细胞多倍体化具有调控作用

致谢

参考文献

附录：攻读博士期间发表的论文