基于计算机模拟、自组装和力谱技术的蛋白质分子间相互作用研究

摘要

蛋白质是生命的基础，它是生物体内一切功能活动的主要执行者。生物体内的机制大部分是经由蛋白质与蛋白质之间的相互作用而发挥生理功能。基于抗原或抗体的蛋白质分子间的相互作用研究是蛋白质分子间相作用研究的重要领域。本文以胰岛素(INS)和胰岛素降解酶(IDE)、人免疫球蛋白G(人IgG，以下简称抗原)和大鼠抗人IgG蛋白质(以下简称抗体)为模型系统，主要进行了以下几个方面的研究：
　　 (1)采用用于生物系统相互作用的二维图形学实验室(2D-GraLab)的分子模拟方法对INS(PDB序列号2jv1)和IDE(PDB序列号2jg4)相互作用进行模拟，以谋求获得蛋白质间相互作用的形式和内涵。结果显示INS和IDE的结合过程中主要存在着溶剂化效应和范德华力相互作用。其中，复合物A链和B链对结合的溶剂化自由能分别做出了-4.288 kcal/mol和-5.495 kcal/mol的贡献。而复合物A链和B链对结合的范德华力相互作用分别做出了-0.199 kcal/mol和-0.249 kcal/mol的贡献。同时，由残基配对总结图中可知，INS的A链55位THr残基和B链的30位Thr残基之间发生了立体碰撞，其质心间距离为1.71 nm。INS的A链53位His残基和B链4位的Glu残基发生了离子对相互作用，其质心间距离为5.35 nm。
　　 INS界面由疏水性的氨基酸组成，由此形成的强疏水性导致了其在溶液环境中的不稳定性，从而作为一种有效的化学力推动了该分子与IDE发生纳摩尔水平上的结合。IDE和INS在结合界面上发生了分子表面间的密集接触，造成了一个明显的基质镶嵌位点，并形成了一对静电作用的盐桥。与此同时，在范德华形状互补和疏水驱动的协同作用力下，IDE和INS之间瞬时形成了稳定的复合物结构，从而介导下游生物学效应。
　　 (2)运用自组装(SAM)方法制备了16-巯基棕榈酸(MHAI)分子膜，并将抗体分子共价连接在经1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳化二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化后的MHA膜上，从而实现了抗体的固定，获得了均一可控的抗体单分子层。
　　 对制得的抗体单分子层分别采用轻敲模式原子力显微镜(TM-AFM)、掠入射X射线衍射(GIXRD)、X射线光电子能谱(XPS)、接触角(CA)测试等方法对其表征。空白金片、MHA膜和抗体单分子层的二维和三维形貌显示三种不同表面具有截然不同的微结构。GIXRD测试显示MHA膜和抗体单分子层的GIXRD图谱与空白金片显著不同，均在0-150的2θ角范围内有特征峰，但MHA膜和抗体单分子层的GIXRD的峰形及峰位并不一致且具有明显差异。空白金片、MHA膜和抗体单分子层的XPS测试结果表明三种表面的元素组成均与预期的吻合，空白金片的Au结合能图谱与标准图谱一致，在86.6 eV和82.9 eV处存在强峰，经MHA修饰后的金衬底其Au结合能图谱峰位发生了化学位移(移至87.46 eV和91.11 eV处)。MHA膜的S2p结合能图谱在162.17 eV和161 eV处有强峰。在S2p结合能图谱中未发现高于164 eV的峰，意味着制得的MHA膜上不存在游离的MHA分子。抗体单分子层的的N1s结合能图谱在400.55 eV有强峰，提示抗体分子已成功地连接在MHA膜上。CA测试结果显示MHA膜和抗体单分子层的接触角分别为180和140，均具有十分亲水的表面。
　　 此外，本文还测试了MHA与正十二硫醇一系列摩尔比的混合硫醇分子膜的接触角，结果发现接触角随着MHA比例的增大而减小，呈反相关关系，而随着正十二硫醇的所占的比例增大而增大，呈正相关关系。
　　 (3)采用TM-AFM和摩擦力显微镜(FFM)对抗原和抗体分子间的相互作用进行成像学研究。在两种成像方法中，分别对空白金片、抗体单分子层以及抗原/抗体复合物分子层进行成像。在TM-AFM研究中，同时记录其表面形貌图和相位图，对比形貌图和相位图可见三种不同表面的具有不同的微结构，形貌图与相位图互为呼应与验证，表明抗体分子已成功固定在硫醇修饰的金衬底上，抗体与抗原之间发生了特异性识别事件并形成了复合物。
　　 在FFM研究中，不同表面的FFM形貌图显示出不同的表面微结构，提示抗体分子已成功固定在硫醇修饰的金衬底上，抗原修饰的探针与抗体单分子层之间存在相互作用力，封堵实验的结果与预期一致，确认了上述特异性相互作用力的存在。封堵实验结果中出现的较为“平缓”的表面结构是由于在接触模式下针尖的展宽效应所造成的。FFM成像研究与TM-AFM成像研究可互为佐证，表明两者均可用于蛋白质分子间相互作用研究，且在实验过程中发现FFM具有良好的重现性。此外，对成像过程中可能出现的假相，分别举例一一说明并给出了经验性的解决方法。
　　 (4)对抗原和抗体分子间相互作用的粘附力和摩擦力进行研究。粘附力研究结果表明抗原修饰的探针和抗体分子层间、空白探针与抗体分子层、封堵实验以及交换实验的粘附力大小分别为0.6-1.0 nN、0-0.2 nN、0-0.2 nN、1.0-1.2 nN。以上实验表明抗原与抗体间存在着特异性相互作用力。对加载速率因素的考察显示加载速率与粘附力呈两段线性关系。采用泊松分布统计法计算得到单个人IgG和大鼠抗人IgG蛋白质分子间特异性相互作用力大小为144±11 pN，非特异性相互作用为69 pN。
　　 采用FFM研究了抗原和抗体蛋白质分子间相互作用，结果表明法向加载力与摩擦力成正相关关系，抗原分子修饰的探针和抗体蛋白质分子层间、空白探针与抗体分子层、封堵实验、交换实验的摩擦力大小分别为200-250 pN、0-50 pN、50-150pN以及250-300 pN，以上实验表明抗原与抗体间存在着特异性相互作用力，且其值比粘附力小一个数量级。
　　 上述研究结果表明，2D-GraLab是进行蛋白质分子间相互作用理论模拟的有力工具，其结果能为实验研究提供一定的指导；SAM法适用于蛋白质的固定连接，且具有可靠性和易操作性；TM-AFM和FFM成像均可用于蛋白质分子间相互作用的研究，基于AFM的粘附力和摩擦力测试揭示了蛋白质分子间相互作用的力学行为。综上所述，本文从成像与力学两个方面揭示蛋白质相互作用的分子级行为，为生物大分子相互作用研究作出了有益的探讨，并可用于生物传感器、药物筛选等生物医学重要研究领域。

目录

文摘

英文文摘

主要缩略词

1 绪 论

1.1 引言

1.2 常见的蛋白质相互作用研究方法

1.3 基于生物信息学的蛋白质相互作用的分子模拟

1.4 AFM简介

1.5 AFM与蛋白质研究

1.5.1 AFM与蛋白质成像

1.5.2 AFM与蛋白质吸附

1.5.3 AFM与蛋白质折叠及展开

1.5.4 AFM与蛋白质组装

1.5.5 AFM与蛋白质单分子识别

1.5.6 AFM与蛋白质其他研究

1.5.7 AFM与蛋白质研究的展望

1.6 单分子力谱

1.7 蛋白质的固定连接

1.8 摩擦力显微镜

1.9 本文的主要研究内容

1.10 本文的创新之处

2 胰岛素与胰岛素降解酶之间相互作用的分子模拟

2.1 引言

2.22D-GraLab模拟方法与步骤

2.2.1 识别蛋白质结合界面

2.2.2 非成键相互作用

2.2.3 参数设置

2.3 结果与讨论

2.3.1 非成键相互作用的分析和2D布局

2.3.2 INS和IDE相互作用中的溶剂化效应

2.3.3 INS和IDE相互作用的范德华力

2.3.4 INS和IDE相互作用的总结图

2.4 本章小结

3 大鼠抗人IgG蛋白质单分子层的制备及其表征

3.1 引言

3.2 材料与仪器

3.3 实验方法与步骤

3.3.1 金衬底的制备

3.3.2 MHA分子膜的制备

3.3.3 混合SAM的制备

3.3.4 大鼠抗人IgG蛋白质连接在MHA膜上

3.3.5 AFM成像

3.3.6 GIXRD测试

3.3.7 XPS测试

3.3.8 CA测试

3.4 结果与讨论

3.4.1 金衬底的表面修饰

3.4.2 AFM形貌

3.4.3 GIXRD

3.4.4 XPS

3.4.5 CA

3.5 本章小结

4 人IgG与大鼠抗人IgG蛋白质分子间相互作用的成像学研究

4.1 引言

4.2 材料与仪器

4.3 实验方法与步骤

4.3.1 金衬底、SAM、蛋白质分子层的制备

4.3.2 探针的修饰

4.3.3 TM-AFM成像

4.3.4 FFM成像

4.3.5 封堵实验

4.4 结果与讨论

4.4.1 TM-AFM研究人IgG和大鼠抗人IgG蛋白质分子间相互作用

4.4.2 FFM研究人IgG和大鼠抗人IgG蛋白质分子间相互作用

4.4.3 成像分辨率

4.4.4 成像中的假相

4.5 本章小结

5 人IgG与大鼠抗人IgG蛋白质分子间相互作用的力学研究

5.1 引言

5.2 材料与仪器

5.3 实验方法和步骤

5.3.1 金衬底、SAM、蛋白质分子层的制备

5.3.2 探针的修饰

5.3.3 AFM粘附力测试

5.3.4 人IgG与大鼠抗人IgG蛋白质分子间断裂力的计算

5.3.5 摩擦力测试及计算

5.3.6 封堵实验

5.3.7 交换实验

5.4 结果与讨论

5.4.1 蛋白质分子间粘附力曲线的理论模型

5.4.2 人IgG和大鼠抗人IgG蛋白质分子间的粘附力

5.4.3 加载速率与粘附力之间的关系

5.4.4 泊松分布统计法计算人IgG与大鼠抗人IgG之间的断裂力

5.4.5 粘附力测试中的假相

5.4.6 人IgG和大鼠抗人IgG蛋白质分子间的摩擦力

5.5 本章小结

6 主要结论及后续工作建议

6.1 主要结论

6.2 后续工作建议

致谢

参考文献

附录 1

INS和IDE计算机模拟结果图

附 录 2

作者在攻读博士学位期间科研及发表论文情况