生长激素在BMP9介导的间充质干细胞向成骨分化中的作用

摘要

间充质干细胞(Mesenchymal Stem Cells，MSCs)是具有多项分化潜能的成体干细胞，能够分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞和肌肉细胞谱系。干细胞的成骨分化是一个复杂、调控严格的过程，这个过程受一系列内源性和各种环境因子以及信号通路的影响。对间充质干细胞成骨分化机制的研究，有望为临床上治疗骨缺损、骨折及骨不连等病症提供新方案。
　　 在间充质干细胞成骨分化早期，骨形态发生蛋白(Bone MorphogenesisProteins，BMPs)发挥着至关重要的作用。BMPs属于转化生长因子(Transforming Growth Factor，TGF)β超家族成员，是一组具有类似结构的高度保守的分泌型多功能蛋白，在细胞黏附、增殖、分化，骨骼发育和骨组织形成中发挥重要作用。目前发现人BMP家族至少存在15种成员，其中BMP2，BMP4，BMP6，BMP7和BMP9能有效地在体内和体外诱导间充质干细胞向成骨分化。BMP9是骨源性最强的BMP之一，同时也是目前了解得最少的BMP之
　　 我们的前期研究发现，用BMP9腺病毒(Ad-BMP9)感染MSCs后，收集细胞总RNA进行微阵列分析，有大约40个基因的表达发生明显变化。其中，生长激素(Growth Hormone，GH)的表达上调最为显著。这提示生长激素参与了BMP9诱导的间充质干细胞分化过程，并且可能在其中发挥重要作用。生长激素是由垂体分泌的一种蛋白质激素，通过与GH受体结合，或与胰岛素样生长因子Ⅰ(Insulin-like Growth FactorⅠ，IGF-Ⅰ)相互作用，影响骨骼的发育和生长。为了揭示生长激素在BMP9诱导的间充质干细胞成骨分化中扮演的角色，探讨其中的分子机制，本研究首先构建了GH过表达的质粒，并包装相应的腺病毒，其次，在体外、器官培养和体内三个层面上研究GH和BMP9对间充质干细胞成骨分化的影响，最后通过染色质免疫沉淀技术(Chromatin Immunoprecipitation，ChIP)和小分子抑制剂的使用探索其中的调控机制。我们主要的研究内容包括：
　　 ①从Thermo公司购买含有人GH基因片段的质粒，酶切后将GH基因片段连接到腺病毒穿梭质粒上。测序鉴定后，将质粒转入BJAdEasy细胞中进行重组，并筛选阳性克隆。PacⅠ酶切将重组子线性化、纯化，通过脂质体转染到HEK293细胞中进行包装。将病毒命名为AdR..GH。
　　 ②C3H10T1/2细胞购买自ATCC公司，是常用的MSC细胞株。免疫荧光检测C3H10T1/2问充质干细胞标志物的表达。结果显示，C3H10T1/2表达MSC标志物CD29/Integrinβ1，CD44，CD73，CD90/Thy-1，CD117/c-kit，BMPRⅡ，CD133/Proml，CD105/Endoglin和CD166/ALCAM。
　　 ③利用Ad-BMP9感染C3H10T1/2细胞，分别于感染后1、3、5、7天收集细胞总RNA，RT-PCR检测GH的表达。结果显示这4个时间点GH的表达均显著增强。免疫组织化学染色(Immunohistochemistry，IHC)结果表明，GH在发育中长骨生长板的成骨细胞和软骨细胞中表达。体外实验设置4个组：Ad-GFP/Ad-RFP(对照组)，Ad-GFP/AdR-GH，Ad-BMP9/Ad-RFP，Ad-BMP9/AdR-GH，用这4组病毒分别刺激MSCs，并检测成骨细胞分化标记物的表达。这些标志物包括碱性磷酸酶(Alkaline Phosphatase，ALP)，骨钙素，骨桥蛋白和基质的矿化作用(茜素红染色)。结果表明，GH本身不能启动MSCs的成骨分化，而当GH和BMP9共同作用时，成骨分化标志物的表达明显强于其他3组，说明GH在体外能促进BMP9介导的MSCs成骨分化。
　　 ④在器官培养的实验中，我们截取胚胎期E18.5天的小鼠后肢进行培养，并利用上述4组病毒感染组织。将钙黄绿素作为荧光指示剂加入培养基中追踪骨发育过程，在病毒感染后2、4、8、12天测量记录胫骨横截面荧光面积。结果显示，与对照组相比，单独的BMP9能有效促进骨生成，但BMP9和GH组合的促进效果更为显著。苏木精-伊红(Haematoxylin and eosin，H&E)染色结果显示，Ad-BMP9/AdR-GH组中肥大软骨区域大于对照组。这些结果表明，GH能促进BMP9介导的软骨内成骨。
　　 ⑤利用上述4组病毒感染C3H10T1/2细胞36小时后，收集细胞注射到无胸腺裸鼠皮下。注射4周后，处死裸鼠，收集移植部位进行微型计算机断层扫描(Microcomputed Tomography，MicroCT)。通过Amira5.3软件将扫描结果进行三维重建并进行统计分析。仅感染Ad-BMP9/Ad-RFP或Ad-BMP9/AdR-GH病毒的MSCs能生成异位骨，且BMP9和GH共同诱导的MSCs形成的异位骨骨量更多，骨密度更大。H&E染色以及骨钙素、骨桥蛋白的免疫组织化学染色结果显示，BMP9诱导生成的异位骨中形成部分成熟的骨基质和骨小梁，同时可观察到未分化的间充质祖细胞。而由BMP9和GH共同诱导生成的异位骨中存在更多的成熟骨基质和更大，更厚的骨小梁，未分化的间充质祖细胞相对较少。Masson'sTrichrome染色结果显示，GH增强了BMP9诱导的基质矿化作用。
　　 ⑥在GH启动子区域寻找假定的Smad结合位点，据此设计两对PCR寡核苷酸序列用于ChIP分析。亚融合的C3H10T1/2细胞被AdGFP或AdBMP9感染30个小时。交联细胞，超声破碎基因组DNA，然后用抗Smad1/5/8抗体进行免疫共沉淀。分别用两对引物与获得的基因组DNA进行PCR反应。结果发现，抗-Smad1/5/8抗体能拖下含有GH启动子区域的基因组片段。表明GH是MSCs中BMP9诱导的Smad信号的一个下游靶点。在BMP9或BMP9/GH诱导培养的MSCs中分别加入STAT3、STAT5、JAK的小分子抑制剂后，于第5、7天检测ALP活性。结果表明，这几种抑制剂均能有效地抑制BMP9介导的ALP活性，同时，BMP9和GH协同诱导的ALP活性也受到明显抑制。此外，RT-PCR结果显示，GH能诱导IG目的表达，并且GH诱导的IGF1表达能被JAK和STAT5抑制剂抑制。
　　 综合以上研究结果，我们认为生长激素与BMP9存在协同作用，通过激活JAK/STAT/IGF1信号通路促进间充质干细胞的成骨分化。