植物病原真菌与昆虫病原真菌侵染寄主表皮的分子机制研究

摘要

稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae）是水稻最重要的传染性真菌病害，作为病原真菌致病机理研究的模式物种，其分子致病机制已被深入研究，而金龟子绿僵菌（Metarhizium anisopliae）是研究昆虫病原真菌致病机理的模式真菌，广泛应用于害虫的生物防治。稻瘟病菌与绿僵菌分别侵染寄主表皮的过程十分相似，深入研究这两种致病真菌，比较它们致病机制的异同，有助于阐明真菌侵染动植物的分子机制，可为植物真菌病害防治、杀虫真菌农药研制提供新的理论依据，对于植物病虫防治有着十分重要的意义。
　　侵染寄主植物表皮过程中，稻瘟病菌依靠细胞自噬，降解并回收分生孢子内的营养物质、细胞器等，从而为附着胞的发育成熟及膨胀压的累积提供物质保证。因此，揭示稻瘟病菌的细胞自噬相关分子调控机制，对于认识稻瘟病菌附着胞发育相关的分子机理、以及开发新的稻瘟病防治靶标具有重要意义。研究金龟子绿僵菌在寄主体表萌发、分化时期的基因表达情况，并与稻瘟病菌等植物病原真菌进行比较分析，能够为挖掘虫生真菌基因资源、鉴定金龟子绿僵菌的重要毒力性状基因、揭示其致病的分子机理提供丰富信息。
　　本文通过分析稻瘟病菌MoVAC8、MoTSC13、MoTOR2和MoATG1基因的功能，对稻瘟病菌侵染寄主植物表皮时细胞核降解的分子机理和自噬调控机理进行了研究。同时对绿僵菌侵染寄主蝗虫体表时的基因表达进行了系统分析，比较了绿僵菌与稻瘟病菌之间致病机制的异同。
　　①有关稻瘟病菌的主要研究结果如下：
　　1）VAC8和TSC13是酵母细胞核逐步微自吞（piecemeal microautophagy of nuclues，PMN）通路的关键基因，两者在稻瘟病菌中的同源基因分别是MoVAC8和MoTSC13。酵母互补试验和酵母荧光蛋白yEGFP标记试验表明VAC8基因在稻瘟病菌和酵母之间具有一定的功能保守性，而 TSC13的基因功能在酵母与稻瘟病菌之间高度保守。
　　2）GFP荧光蛋白标记试验表明，稻瘟病菌的MoVAC8蛋白定位于细胞液泡膜表面，而MoTSC13分布在细胞核外膜和内质网膜表面。GFP融合试验表明MoVAC8蛋白的SH4结构域在MoVAC8蛋白中发挥膜定位信号肽的功能。基因定点突变试验表明，MoVAC8蛋白 SH4结构域内的肉豆蔻酰修饰位点甘氨酸（glycine）和3个棕榈酰修饰位点半胱氨酸（cysteine）影响MoVAC8蛋白的正确膜定位以及蛋白参与咖啡因胁迫应答的功能。
　　3）MoVAC8基因缺失突变体⊿Movac8对寄主水稻具有完全的致病能力，但对咖啡因高度敏感。与野生型相比，MoTSC13基因缺失突变体⊿Motsc13突变体的营养菌丝生长和产孢能力下降，对渗透压胁迫和细胞壁干扰剂的敏感性增加，突变体附着胞分化出侵染钉的比例显著降低，并且侵染菌丝增殖能力下降，从而导致致病力降低。
　　4）红色荧光蛋白RFP标记稻瘟病菌细胞核的荧光显微观察结果表明，细胞自噬突变体⊿Moatg1和⊿Moatg4在附着胞发育过程中，都不能顺利降解分生孢子内的细胞核，而突变体⊿Movac8和⊿Motsc13的细胞核都可以正确降解。共表达MoVAC8:GFP和H1:RFP的稻瘟病菌转化菌株、以及共表达 MoTSC13:GFP和H1:RFP的稻瘟病菌转化菌株中，酵母 PMN通路的典型亚细胞结构均不能被观察到。以上结果表明，稻瘟病菌侵染相关的细胞核降解过程依赖于非选择性自噬核心基因MoATG1和MoATG4，而与MoVAC8和MoTSC13的基因功能无关。
　　5）基因序列分析表明，MoTOR2编码2469个氨基酸组成的蛋白，含有TOR蛋白保守的结构域，包括N端的HEAT重复单元和FAT结构域，以及C端的FRB结构域、激酶结构域和FATC结构域。GFP启动子融合试验和定量PCR试验表明，MoTOR2基因在侵染阶段和营养生长阶段组成型表达。
　　6）MoFKBP12基因的缺失突变体⊿Mofkbp12的表型分析和酵母双杂交试验表明，雷帕霉素作为TOR蛋白的特异性激酶活性抑制剂，介导 MoFKBP12蛋白与MoTOR2蛋白FRB结构域之间的相互作用。雷帕霉素能够抑制稻瘟病菌营养菌丝的生长、附着胞发育过程中营养物质的分解、细胞有丝分裂、分生孢子内的细胞自噬体的减少、附着胞内细胞自噬体的增加，并能刺激分生孢子分化形成多个附着胞。
　　7）以MoTOR2基因内FRB和FAT结构域的编码区为RNAi干扰靶标，采用NaAc化学诱导基因沉默，成功下调了MoTOR2基因在营养菌丝生长以及附着胞发育过程中的表达水平。干扰转化子的表型分析表明，MoTOR2调控分生孢子的细胞自噬和致病力。通过RNAi在附着胞中特异性下调MoTOR2表达水平时，稻瘟病菌附着胞形成不受影响，但其对寄主的致病能力下降。MoTOR2及MoLST8基因在附着胞中同时特异超表达时，附着胞内自噬体数量和稻瘟病菌的致病能力不受影响。
　　8）GFP荧光蛋白标记试验表明，MoATG1蛋白广泛分布在细胞质中，并在一些区域富集呈点状，这些点状区域的数量变化趋势与自噬体的数量变化趋势相一致，并且GPF:MoATG1融合蛋白的点状富集区域能与mRFP标记的自噬体部分共定位。MoATG1基因定点突变试验表明，MoATG1蛋白激酶结构域中与激酶活性相关的3个保守氨基酸在稻瘟病菌细胞自噬体的形成和致病过程中发挥关键作用。
　　②有关蝗绿僵菌的主要研究结果如下：
　　1）构建了绿僵菌侵染寄主蝗虫体表阶段的全长均一化 cDNA文库，共挑取8215个文库克隆进行测序，获得7302条高质量表达序列标签序列（Expressed sequence tag，EST），聚类拼接为4739条unique ESTs，其中包括1089条contigs和3650条singlets。
　　2）与绿僵菌基因组文库的比对分析表明，4711条ESTs序列均由绿僵菌所表达，其中包括已报道的绿僵菌毒力基因。通过基因注释和功能归类，对unique ESTs进行生物学功能预测与分析，揭示了绿僵菌为适应寄主体表环境所采用的多种基因表达策略，主要包括：降解昆虫体壁成分、转运胞外营养物质至胞内、调控碳源及氮源等代谢途径、启动信号传导通路、合成及重建细胞壁结构、胞吞和胞泌、调节细胞周期及生长、对抗环境或宿主胁迫等。寄生菌-宿主相互作用数据库比对结果表明，参与以上生物学过程的许多绿僵菌同源基因很可能编码重要的毒力因子。
　　3）半定量分析结果表明，随机选取的44条参与不同生物学过程的绿僵菌ESTs均在附着孢形成时期表达，其中26条ESTs在基本培养基生长时期、蝗虫后翅上附着胞形成时期以及蝗虫血淋巴定殖时期都有表达，18条ESTs只在营养匮乏的基本培养基和蝗虫后翅培养条件下表达，这表明绿僵菌在体表侵染阶段和体内定殖阶段通过差异调控某些基因来适应不同的寄生环境。
　　4）稻瘟病菌 PLS1基因在附着胞分化形成侵染钉的过程中发挥至关重要的作用。我们从所建的绿僵菌EST库中直接克隆了绿僵菌PLS1同源基因的全长cDNA序列。通过菌落原位杂交，从绿僵菌基因组文库中克隆了MaPLS1的全长基因序列，southern杂交表明MaPLS1在绿僵菌基因组中以单拷贝形式存在。对MaPLS1蛋白的序列特征、进化关系的分析表明，MaPLS1蛋白隶属于真菌tetraspanin家族。
　　5）绿僵菌与稻瘟病菌等植物病原真菌在进化上具有亲缘关系，绿僵菌与稻瘟病菌等植物病原真菌之间基因表达的比较分析表明，绿僵菌可能采用一些类似于植物病原真菌的基因表达策略或保守的功能基因来侵染寄主体表。
　　本文有关稻瘟病菌侵染相关的自噬分子机理、绿僵菌侵染寄主蝗虫体表阶段的基因表达策略、以及绿僵菌与稻瘟病菌等植物病原真菌之间侵染寄主分子机制的比较研究，深化了我们对两种病原真菌侵染机理的认识，也为病原真菌的防治和利用奠定了理论基础。

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缩略词

1 绪论

1.1 引言

1.2 稻瘟病菌侵染机理研究进展

1.3 绿僵菌侵染机理研究进展

2 稻瘟病菌MoVAC8和MoTSC13的基因功能研究

2.1 研究背景

2.2 研究内容与技术路线

2.3 材料与方法

2.4 结果和分析

2.5 讨论

3 稻瘟病菌MoTOR2基因在细胞自噬过程中的功能研究

3.1 研究背景

3.2 研究内容与技术路线

3.3 材料与方法

3.4 结果和分析

3.5 讨论

4 稻瘟病菌MoATG1基因在细胞自噬过程中的功能研究

4.1 研究背景

4.2 研究内容与技术路线

4.3 材料与方法

4.4 结果和分析

4.5 讨论

5 绿僵菌侵染寄主体表阶段全长均一化cDNA文库的构建与

5.1 研究背景

5.2 研究内容和技术路线

5.3 材料与方法

5.4 结果和分析

5.5 讨论

6 绿僵菌MaPLS1全长基因的克隆与序列分析

6.1 研究背景

6.2 研究内容与技术路线

6.3 材料与方法

6.4 结果与分析

6.5 讨论

7 绿僵菌与稻瘟病菌之间ESTs的比较分析

7.1 研究背景

7.2 研究内容和技术路线

7.3 材料与方法

7.4 结果与分析

7.5 讨论

8 全文小结与后续工作建议

8.1 全文小结

8.2 本论文创新点

8.3 后续工作建议

致谢

参考文献