神经嵴样干细胞参与肌腱自发修复的机制及其应用于肌腱再生的实验研究

摘要

肌腱/韧带损伤是一个非常常见的临床问题,约占骨科病例的一半左右。目前的治疗方法主要停留在理疗、手术缝合以及自体、异体或假体移植阶段,虽有一定疗效,但作用有限,有待于开发更完善的治疗方法。但是,目前对肌腱损伤修复机理的了解有限,阻碍了新疗法的开发。近年来肌腱干细胞的发现,为肌腱损伤的治疗提供了新的视角。本研究拟从肌腱损伤后自发修复的角度出发,探索此进程中肌腱干细胞的参与机制,进而尝试将此类干细胞应用于肌腱再生。
　　本文的主要工作和结果如下:
　　1.神经嵴样肌腱干细胞的分离、培养和鉴定。
　　为研究肌腱干细胞的特性,以大鼠膑腱(patellartendon)为对象,获取肌腱单细胞悬液。低密度接种后,细胞呈克隆生长,呈现5种克隆形态,克隆形成率为5-8％,表明肌腱源细胞具有克隆形成能力;悬浮成球培养,细胞成克隆球生长,传代后继续成球生长,表明肌腱源细胞具有自我更新能力;多向分化检测,肌腱源细胞具有向骨、软骨、脂肪、平滑肌、神经元、施旺细胞分化能力,具有多潜能性。因而,本研究分离的肌腱源细胞符合干细胞定义,是一种多能干细胞。进一步鉴定表明,肌腱干细胞表达干细胞表面标志物CD54,CD29,不表达内皮细胞表面标志物CD34和血液细胞表面标志物CD45,CD11b/c,表明本研究培养的干细胞并非来源于血管内皮或血液谱系细胞;免疫荧光检测表明,此类干细胞表达肌腱细胞相关蛋白Decorin,说明肌腱干细胞仍具有肌腱谱系的特性;此外还表达神经嵴干细胞标志物P75、Vimentin、Snail和Sox10,表明肌腱干细胞具有神经嵴干细胞样特性。综上,本研究分离培养的肌腱来源的干细胞,具有向间充质谱系和神经谱系分化的能力,且表达神经嵴干细胞的标志物,因而,本文将其命名为神经嵴样肌腱干细胞(neuralcrest-liketendonstemcells,NCL-TSCs)。
　　2.神经嵴样干细胞参与肌腱损伤后的自发修复。
　　为探索NCL-TSCs在体内的定位,本研究以大鼠膑腱为对象,以α-smoothmuscleactin(SMA)为血管细胞标志物、p75neurotrophinreceptor(P75)为NCL-TSCs标志物,行冰冻切片免疫荧光。结果显示,肌腱中SMA+细胞主要分布于肌腱周边的滑膜(synovium)部分,其次分布于肌腱实质部分(midsubstance)的腱内膜(endotenon),P75+细胞数量稀少,主要分布于微血管的周围。为研究P75+细胞在肌腱自发修复中的作用,制造大鼠膑腱开窗缺损建立肌腱损伤模型,冠状面切片显示,损伤后滑膜增生,伴随着滑膜向缺损部位的浸润,血管细胞迁入损伤部位,同时P75+细胞大量出现。超微观察显示,这些P75+细胞可能来自于血管周围,在损伤后离开血管壁,进入间质,且产生大量的ECM,参与肌腱的自发修复进程。流式分选这群P75+细胞,鉴定表明其表达一系列神经嵴干细胞标志物。
　　3.诱导多潜能干细胞来源的神经嵴干细胞促进损伤肌腱的再生。
　　为进一步探索神经嵴样干细胞在肌腱修复中的应用,本研究以诱导多潜能干细胞来源的神经嵴干细胞(inducedpluripotentstemcell-derivedneuralcreststemcells,iPSC-NCSCs)为种子细胞;制造大鼠膑腱开窗缺损,填充iPSC-NCSCs/水凝胶复合物,建立肌腱再生动物模型,研究iPSC-NCSCs再生肌腱能力。术后4周外观观察,与对照组相比iPSC-NCSCs处理组肌腱修复更完全。组织学分析显示,iPSC-NCSCs能促进损伤部位胶原的生成。肌腱相关ECM蛋白分析表明,iPSC-NCSCs能增强损伤部位ECM的沉积。力学测试表明,iPSC-NCSCs处理组肌腱表现出更好的生物力学特性。进一步探讨iPSC-NCSCs促进肌腱修复的潜在机制,结果表明植入后的iPSC-NCSCs通过在损伤肌腱中分化产生肌腱相关蛋白直接参与再生,同时还产生一系列干细胞招募因子和腱系分化因子,可能激活宿主干细胞并诱导其分化,进而促进宿主自身的修复。
　　总之,本文系统研究了肌腱中栖息的神经嵴样干细胞的特性,初步探明了其在肌腱损伤后自发修复中的作用,并进一步探索了iPSCs来源的神经嵴干细胞在肌腱再生中的效用和机制,为开拓基于此类干细胞的新研究领域和新治疗方法奠定了一定的研究基础。

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英文摘要

目录

1 绪 论

1.1 问题的提出与研究意义

1.2 国内外研究现状

1.3 本文的研究目的和研究内容

2 神经嵴样肌腱干细胞的分离、培养和鉴定

2.1 引言

2.2 实验材料与试剂

2.3 实验方法

2.4 实验结果

2.5 分析与讨论

2.6 本章小结

3 神经嵴样干细胞参与肌腱损伤后的自发修复

3.1 引言

3.2 实验材料与试剂

3.3 实验方法

3.4 实验结果

3.5 分析与讨论

3.6 本章小结

4 诱导多潜能干细胞来源的神经嵴干细胞促进肌腱再生

4.1 引言

4.2 实验材料与试剂

4.3 实验方法

4.4 实验结果

4.5 分析与讨论

4.6 本章小结

5 结论与展望

5.1 本文主要结论

5.2 后续工作展望

致谢

参考文献

附录

A.作者攻读博士学位期间发表的论文目录

B.作者攻读博士学位期间取得的科研成果目录

C.作者攻读博士学位期间参加的科研项目