斜纹夜蛾感染莱氏野村菌后差异表达基因的鉴定及功能研究

摘要

我国是世界上最大的蔬菜生产国家和消费国家,保障蔬菜稳定生产和供应任务艰巨,而蔬菜病虫害的发生是导致蔬菜减产的一个主要原因。在我国,每年因斜纹夜蛾病虫害的发生导致蔬菜生产损失巨大。目前对斜纹夜蛾的防治主要依赖于化学农药,化学农药的长期施用不仅加深了对环境的污染,而且增加了斜纹夜蛾的抗药性,由此导致对斜纹夜蛾的防治越来越困难。莱氏野村菌作为斜纹夜蛾重要的一类昆虫病原真菌,能够有效防治斜纹夜蛾病虫害的发生并不会导致昆虫抗药性的产生。加强对斜纹夜蛾和莱氏野村菌相互作用机制的研究有利于高效杀虫靶标的筛选和优化农药杀虫策略。
　　本研究以莱氏野村菌CQNr129和斜纹夜蛾为研究材料,利用消减杂交技术筛选正常和感染莱氏野村菌的斜纹夜蛾脂肪体中差异表达基因。对差异表达基因硫氧还蛋白过氧化物酶(Thioredoxinperoxidase,SlTpx)和半胱氨酸蛋白酶(Cysteineproteinases,SlCyP)进行克隆,表达,定位和功能分析,深入研究SlTpx和SlCyp在防御莱氏野村菌侵染过程中的机理,为后续斜纹夜蛾免疫防卫的分子水平研究和昆虫与病原微生物相互作用的机理研究奠定基础,同时也为寻找更多有效的杀虫靶标、开发高毒杀虫莱氏野村菌菌株和设计杀虫策略提供理论依据。
　　本研究主要研究结果和结论如下:
　　①斜纹夜蛾感染莱氏野村菌后差减文库的建立
　　1)借助差减杂交技术分离了感染莱氏野村菌的斜纹夜蛾脂肪体差异表达基因。结合斑点杂交我们从1175个单克隆中筛选出了345个阳性克隆,经过测序和拼接最终得到117条特异表达的基因序列。通过BLAST数据库,GO数据库以及相关文献确定了117条Unigene潜在的生物学功能,根据他们所行使的生物学功能的不同,将它们分为7大类。在这117条序列中,有74条在非冗余蛋白序列数据库中找到同源序列,参与了不同的生物学过程,其余43条序列被归类到未知功能一类。在找到的117条Unigene中只有2条在斜纹夜蛾物种中有相关文献进行了研究报道,而其余115条通过BLASTn没有找到在斜纹夜蛾物种中与其相似序列,这说明这115条序列是在斜纹夜蛾中首次发现。
　　2)通过半定量分析,随机筛选的7个基因在斜纹夜蛾感染莱氏野村菌后的脂肪体中有较高水平表达。通过实时荧光定量分析,Hsp70基因、Hsp90基因、gallerimycin抗真菌肽基因和半胱氨酸蛋白酶基因表达在斜纹夜蛾机体内被莱氏野村菌侵染后都显著上调。
　　本研究建立了斜纹夜蛾感染莱氏野村菌后脂肪体差减文库,筛选鉴定了117条差异表达基因,其中115条基因在斜纹夜蛾中首次发现。进一步研究分析表明这些基因参与了斜纹夜蛾不同生物学功能并能被莱氏野村菌侵染后显著上调表达,本研究为斜纹夜蛾免疫防卫的分子水平研究和斜纹夜蛾与莱氏野村菌相互作用的机理研究奠定基础。
　　②斜纹夜蛾硫氧还蛋白过氧化物酶基因的功能研究
　　1)斜纹夜蛾硫氧还蛋白过氧化物酶cDNA全长1165bp序列,翻译195个氨基酸。多序列比对显示斜纹夜蛾同其他昆虫的硫氧还蛋白过氧化物酶的氨基酸序列的相似性在70％以上。进化树分析斜纹夜蛾硫氧还蛋白过氧化物酶同鳞翅目昆虫的硫氧还蛋白过氧化物酶的亲源关系较近,聚类在一起。
　　2)将硫氧还蛋白过氧化物酶在大肠杆菌中的融合表达,并对融合表达蛋白酶学功能进行研究发现它具有抗氧化,清除过氧化氢并保护DNA免受损伤的能力。
　　3)通过组织定位发现,在mRNA水平上斜纹夜蛾硫氧还蛋白过氧化物酶在各个组织都能检测到,并能被莱氏野村菌侵染后上调表达,在正常斜纹夜蛾和莱氏野村菌侵染24h后的斜纹夜蛾中,硫氧还蛋白过氧化物酶在血细胞中的表达量都是最高的。通过免疫印迹发现,硫氧还蛋白过氧化物酶蛋白在正常斜纹夜蛾的血细胞和表皮系统中有检测到,莱氏野村菌侵染后,在头,血细胞,脂肪体,中肠以及马氏管中都有检测到,而在血清以及表皮中没有检测到。
　　4)斜纹夜蛾感染莱氏野村菌后,其血细胞中硫氧还蛋白过氧化物酶的mRNA和蛋白的表达趋势跟过氧化氢处理后的表达趋势相同。同时我们检测了莱氏野村菌侵染后斜纹夜蛾血细胞内的氧化应激反应水平,发现斜纹夜蛾机体内的氧化应激反应水平显著增加,进而影响斜纹夜蛾硫氧还蛋白过氧化物酶的表达水平变化。
　　5)通过对斜纹夜蛾硫氧还蛋白过氧化物酶干扰等实验,发现干扰之后的斜纹夜蛾对莱氏野村菌敏感性增加并加速死亡,半致死时间显著缩短。
　　本研究克隆了斜纹夜蛾硫氧还蛋白过氧化物酶,功能研究结果显示斜纹夜蛾硫氧还蛋白过氧化物酶具有抗氧化,清除过氧化氢的能力。它被莱氏野村菌侵染后基因和蛋白表达显著上调,硫氧还蛋白过氧化物酶基因转录水平表达通过干扰下调之后,干扰组斜纹夜蛾抵抗莱氏野村菌的能力显著下降,表明斜纹夜蛾硫氧还蛋白过氧化物酶在抵抗莱氏野村菌侵染的过程中发挥了重要作用。
　　③斜纹夜蛾半胱氨酸蛋白酶基因的功能研究
　　1)克隆斜纹夜蛾半胱氨酸蛋白酶cDNA全长序列,全长序列翻译344个氨基酸。多序列比对显示斜纹夜蛾半胱氨酸蛋白酶氨基酸序列同其他昆虫的半胱氨酸蛋白酶蛋白序列的相似性在75%以上。进化树分析斜纹夜蛾半胱氨酸蛋白酶同鳞翅目昆虫的半胱氨酸蛋白酶的亲源关系较近,聚类在一起。
　　2)通过实时荧光定量和Westernblotting结果发现,斜纹夜蛾各组织中半胱氨酸蛋白酶无论是在mRNA水平还是在蛋白水平都能在被莱氏野村菌侵染后上调表达。在正常和被莱氏野村菌侵染24h后的斜纹夜蛾中,半胱氨酸蛋白酶在血细胞中的表达量都是最高的,其次是脂肪体中。
　　3)斜纹夜蛾感染莱氏野村菌后,半胱氨酸蛋白酶的mRNA及蛋白在斜纹夜蛾血细胞以及脂肪体中的表达都显著上调。同时我们检测了莱氏野村菌侵染后斜纹夜蛾血淋巴中半胱氨酸蛋白酶水解活性,发现侵染后的斜纹夜蛾血淋巴中半胱氨酸蛋白酶酶活水平要比正常和PBS处理的斜纹夜蛾中半胱氨酸蛋白酶的酶活要高。
　　4)检测了斜纹夜蛾半胱氨酸蛋白酶在各个发育阶段的表达以及酶活变化,结果显示斜纹夜蛾半胱氨酸蛋白酶的mRNA以及蛋白在六龄脱皮及变态发育时期的表达显著上调。同时斜纹夜蛾半胱氨酸蛋白酶酶活也在这两个发育时期显著增加。
　　5)斜纹夜蛾半胱氨酸蛋白酶干扰实验结果显示,干扰处理后的斜纹夜蛾幼虫,蛹以及成虫表型产生变化,并且斜纹夜蛾对莱氏野村菌的侵染敏感性显著增加并导致其死亡加速,半致死时间显著缩短。
　　本研究克隆了斜纹夜蛾半胱氨酸蛋白酶,研究表明斜纹夜蛾半胱氨酸蛋白酶在昆虫发育过程中参了重要的功能,尤其是在变态发育期间。研究显示半胱氨酸蛋白酶不仅能被莱氏野村菌侵染后表达显著上调,并且其转录水平通过干扰下调之后,干扰组斜纹夜蛾抵抗莱氏野村菌的能力显著下降,说明在抵抗莱氏野村菌侵染的过程中发挥了重要作用。
　　综上所述,本研究成功建立了斜纹夜蛾感染莱氏野村菌后的差减文库,筛选出了在斜纹夜蛾物种中尚未报道的差异表达基因115条,并对差异表达基因硫氧还蛋白过氧化物酶以及半胱氨酸蛋白酶的表达模式,酶活,组织定位,功能等进行了探索和研究。本研究为斜纹夜蛾免疫防卫分子水平研究以及斜纹夜蛾与莱氏野村菌相互作用机理研究奠定基础,为推动寻找有效的杀虫靶标和设计杀虫策略提供理论依据。

目录

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中文摘要

英文摘要

目录

1 绪 论

1.1 引言

1.2 昆虫病原真菌侵染过程和致病机理

1.3 寄主防御真菌机理

1.4 硫氧还蛋白过氧化物酶研究现状

1.5 半胱氨酸蛋白酶研究现状

1.6 研究内容及技术路线

2 斜纹夜蛾感染莱氏野村菌后其脂肪体差异表达基因的筛选与分析

2.1 引言

2.2 材料

2.3 实验步骤

2.4 结果与分析

2.5 讨论

2.6 小结

3 斜纹夜蛾硫氧还蛋白过氧化物酶基因功能研究

3.1 引言

3.2 材料

3.3 实验步骤

3.4 结果和分析

3.5 讨论

3.6 小结

4 斜纹夜蛾半胱氨酸蛋白酶基因功能研究

4.1 引言

4.2 材料

4.3 实验步骤

4.4 结果和分析

4.5 讨论

4.6 小结

5 结语和展望

5.1 论文取得的主要研究结果

5.2 存在的不足及后续工作建议

致谢

参考文献

附录