一个新的肺纤维化相关的α-SMA基因转录激活子—HMG1的克隆与初步功能研究

摘要

目的：哮喘气道重塑、肺间质纤维化以及其它许多纤维化性疾病的一个共同病理过程就是表达α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的肌纤维母细胞的异常活化与增多。研究α-SMA表达调控，这对于揭示纤维化相关疾病的发病机制将具有十分重要的意义。然而迄今为止人们对α平滑肌肌动蛋白表达的转录调控机制仍了解甚少，还有许多重要的转录因子和反应元件尚未被发现和揭示。我们在前期的研究工作中利用核酸-蛋白亲和层析方法筛选到了一个属于高迁移率蛋白家族-1(HMG-B1)成员的，可能参与α-SMA启动子活化的蛋白-HMG-1。本研究主要探讨了HMG-1作为转录因子参与调控α-SMA基因转录的可能性，以及对α平滑肌肌动蛋白表达的影响。 方法：1、构建α-SMA启动子红色荧光报告质粒。 2、提取小鼠肺组织的总RNA用RT-PCR方法克隆HMG-1序列并将其亚克至真核表达载体pcDNA3.O和绿色荧光报告载体pEGFP-N2上。 3、将α-SMA启动子红色荧光报告质粒和HMG-1真核表达载体质粒共转染到3T3细胞和16HBE细胞中观察过表达HMG1对α-SMA启动子活化的影响。 4、用RT-PCR检测转染HMG1真核表达载体细胞中α-SMA基因转录水平。 5、建立博莱霉素致肺纤维化的小鼠动物模型，应用HMG1RNAi干扰HMG1的表达，Westernblot检测α-SMA蛋白表达水平。 6、电泳迁移率分析(EMSA)检测HMG1和α-SMA启动子CArGA序列特异性的结合。 结果：1、酶切鉴定及测序结果证实成功构建了α-SMA启动子红色荧光报告质粒pDsRed-SMA，HMG-1绿色荧光报告质粒pEGFP-N2-HMG1及pcDNA3.0-HMG质粒。 2、转染pEGFPn2-HMG的16HBE细胞，绿色荧光蛋白的表达主要定位于细胞核，与转染空载体pEGFPn2的细胞明显不同。RT-PCR结果证实转染细胞能够表达外源HMG基因。 2、共转染pDsRed-SMA启动子红色荧光报告质粒和pcDNA3.O-HMG真核表达质粒显示：细胞过表达HMG-1能够活化α-SMA启动子。转染pcDNA3.O-HMG质粒的16HBE细胞显著增加α-SMA基因转录。 3、Westernblot结果显示博莱霉素致纤维化小鼠肺组织HMG1表达较同期正常对照小鼠显著增加，相应α-SMA水平亦较正常小鼠增加，应用HMG1RNAi治疗的纤维化小鼠肺组织HMG1表达被下调，与此亦同样观察到α-SMA水平下降。 结论： 1、初步证明我们在博莱霉素致纤维化小鼠肺筛选的HMGB1蛋白家族成员HMG1能够作为转录因子上调α-SMA基因的转录激活。 2、HMG1在肺纤维化的过程中被诱导表达增高，可以通过与α-SMA启动子特异性结合激活α-SMA启动子，上调α-SMA基因的表达，从而在肌纤维母细胞持续活化的调控中发挥重要作用。

目录

中英文对照词汇表

前言

第一部分α-SMA启动子红色荧光报告载体的构建

第二部分HMG1对α-SMA启动子活化过程中的功能分析

讨论

结论

参考文献

附：图表

致谢