骨髓基质细胞联合细胞因子对脐血CD133细胞体外扩增和粘附分子表达的影响

摘要

造血干细胞(HSC)移植在治疗自血病、恶性肿瘤、重症非恶性血液系统疾病以及某些遗传性疾病中有肯定的疗效，是某些白血病和恶性淋巴瘤的唯一根治手段。脐血作为一种重要的造血干细胞移植的供源，具有造血干/祖细胞含量高、来源丰富、易于采集、GvHD发生率低等优点，但由于单份脐血所含的有核细胞及造血干/祖细胞的绝对数量有限，影响脐血造血干细胞移植后骨髓造血功能的恢复，较骨髓移植或外周血造血干细胞移植要慢，也导致脐血造血干细胞移植只能主要用于低体重儿童患者。脐血的体外扩增技术有可能解决这一难题，使单份脐血用于高体重的儿童及成人患者移植。本研究采用胎儿骨髓基质细胞联合细胞因子的造血细胞体外培养体系，研究脐血MNC中CD133<'+>细胞在此培养体系的扩增效果，并检测CD133<'+>细胞表面黏附分子CD44、CD62L的表达率，评估扩增后的脐血CD133<'+>细胞的归巢能力。 材料与方法: 1．材料来源 自然流产的胚胎(4-5月)3个经患者知情同意采自本院；足月妊娠的健康产妇脐血采自本院，共10份，ACDA抗凝。 2．方法 (1)骨髓基质细胞滋养层的建立：无菌条件下冲出骨髓液，经淋巴细胞分离液离心后获得MNC，以1×10<'6>/cm<'2>接种于含有20％FBS，100U/ml青霉素，100ug/ml链霉素的DMEM-LG培养基中。48小时后全量换液弃去悬浮细胞为原代细胞(F<,0>)，以后每隔5天进行半量换液。贴壁细胞融合达到80％时以0.05％胰酶消化传代后为F<,1>，F<,3>至F<,5>代的基质细胞经15Gyγ射线照射后用于共培养，使用之前用PBS洗涤3次。 (2)脐血MNC的分离：所采脐血在4小时内按4∶1体积比跟HES混匀之后静置30-45分钟沉淀红细胞，吸取上清经Ficoll密度梯度离心分离出单个核细胞(MNC)，用PBS洗涤3次后备用。 (3)脐血MNC的液体培养：采用StemSpan<'TM>SFEM无血清培养体系，SCF、FL、TPO的终浓度均为50ng.ml。实验分为4组：①C组：空白对照组，仅有培养基+MNC；②F组：SCF+FL+TPo+MNC；③s组：基质细胞+MNC；④SF组：基质细胞+SCF+FL+TPO+MNC。脐血MNC的接种密度为1×10<'6>/ml，置37℃、5％CO<,2>、饱和湿度培养箱中培养。分别在第6、10、14天进行半量换液，用流式细胞术检测各组细胞CD133表达的情况，以及各组CD44、CD62L在CD133<'+>细胞表面的表达率。 (4)造血祖细胞集落培养：将细胞按2×10<'5>/ml接种到24孔板Methocult<'TM> MGFH4434半固体培养基中，内含1％甲基纤维素，30％FBS，1％BSA，10<'-4>mol/L2-ME，50ng/ml rhSCF,50ng/ml GM-CSF,10ng/ml rhIL-3，3U/ml rhEPO。造血祖细胞集落培养第14天时在倒置显微镜下计算CFU数。 (5)统计学分析：用SPSS 13.0统计软件包进行分析，结果以均数±标准差(X±S)表示，同组在各时间点比较及各组在同一时间点比较采用方差分析。 结论： 1．骨髓基质细胞联合细胞因子SCF、TPO及FL可以有效的扩增脐血单个核细胞及其中的CD133<'+>细胞，骨髓基质细胞对延缓原始造血细胞的分化具有重要的作用。 2．骨髓基质细胞共培养有利于维持CD133<'+>造血干细胞表面黏附分子CD62L的表达，但对于CD133<'+>细胞表面CD44的表达则无明显影响。

目录

论文说明：缩略词表

前言

研究对象和实验材料

实验方法

结 果

讨论

结论

参考文献

附 图

综 述 CD133+造血干/祖细胞研究进展

致谢