针对HBV S基因反义锁核酸对乙型肝炎病毒转基因鼠抗病毒疗效研究

摘要

中国不仅是一个人口大国，而且也是病毒性肝炎的高发区，仅乙肝病毒携带者就达1．3亿之多。目前尚无特效药。传统中草药因药理机制不十分明确，治疗效果并不理想，而临床常用的干扰素、拉米夫啶等药物的专一性又不高，且容易导致病毒基因变异，因此，寻找一种新的专一性抗HBV药物具有重大的意义。反义寡核苷酸技术的使用，使乙肝基因治疗研究取得了新的突破，但由于反义寡核苷酸容易被组织细胞中的核酸酶降解，以及杂交结合力不强等因素，致使反义核苷酸技术的应用受到限制。锁核酸是最近几年发现的一种抗降解能力强、亲和力高、毒性小、易被机体吸收等特点的新型核酸药物。国外开始利用锁核酸对爱滋病治疗进行研究，而利用该技术对乙肝进行治疗研究国内外尚未见报导。 因此，本课题在体外细胞试验研究成功的基础上，进一步以阳离子脂质体作为锁核酸药物的传递体，采用流体动力学法，从尾静脉注入HBV转基因鼠体内，观察反义锁核酸药物在小鼠体内的抗HBV效果。从以下几个方面进行研究： 1．确定ASODN与阳离子脂质体的最适比例及其包裹形式； 2．确定阳离子脂质体作为基因治疗药物载体在小鼠体内的毒性； 3．确定ASODN在HBV转基因鼠体内的有效剂量及给药方式； 4．观察反义锁核酸在HBV转基因鼠体内的抗病毒效果及其作用规律。 第一部分反义寡聚脱氧核苷酸与阳离子脂质体的最适比例及其包裹形式 目的：探讨反义寡聚脱氧核苷酸（ASODN）与阳离子脂质体的最适比例及其存在方式。 方法：设计合成针对HBV S基因翻译起始区（155～165nt）的11-聚反义寡脱氧核苷酸片段并进行不同修饰，以无菌ddH2O配成系列标准浓度溶液，于260nm波长处，利用UV-2450紫外分光光度计的定量测定功能制作标准曲线。ASODN与脂质体的相对用量以ug/ul表示，配制成不同比例的载ASODN脂质体混悬液，利用超滤管收集各比例载药脂质体离心后的滤液，UV-2450紫外分光光度计检测出各滤液中ASODN的浓度，并按公式（3-mf）/3×100％计算出载药率。利用琼脂糖凝胶电泳检测ASODN在脂质体混悬液中的存在方式。 结果：ASODN的紫外吸光度与其浓度的线性回归方程为：A=0．063C+0．073，R2=0．999。ASODN/脂质体比例为1：0．5、1：1、1：2、1：3和1：4时，载药率分别为71．71％、78．38％、81．45％、83．75％和81．68％。琼脂糖凝胶电泳显示，ASODN/脂质体比例为1：3～1：4时，电泳条带的亮度明显暗于1：0．5～1：2时的电泳条带。 结论：反义寡聚脱氧核苷酸（ASODN）与阳离子脂质体的最适比例为1：3，ASODN主要以被包裹的形式存在于脂质体混悬液中。载药率不随脂质体的用量无限增加。 第二部分阳离子脂质体作为基因治疗药物载体在小鼠体内的毒性 目的：探讨阳离子脂质体在小鼠体内的毒性，以确定脂质体作为基因药物载体的安全剂量。 方法：采用流体动力学法，经尾静脉给小鼠注射不同剂量的阳离子脂质体，对照组注射等量5％GLU液。于注射前、注射后第1天和第3天，经眶静脉采血，采用自动血球计数仪检测外周血中的白细胞（WBC）、淋巴细胞（LY％）、中性粒细胞（GR％）。用722型分光光度计测定血浆中的清蛋白（Alb）、谷丙转氨酶（ALT）、尿素氮（BUN）、肌酐（CR）。同时做脏器组织切片HE染色，观察肝、肾脏组织结构的变化。 结果：与对照组比较，12ul/g剂量以上组的WBC、BUN、CR均明显升高，ALT、Alb无显著性差异。12ul/g剂量以下组无明显变化。与注射前比较，注射后第1天，WBC、BUN、CR显著升高，而注射后第3天除CR外均基本恢复正常。而ALT、Alb无显著性差异。肝肾脏组织切片HE染色，各剂量组间组织结构变化无差异。 结论：阳离子脂质体对小鼠外周血相和肾脏功能的毒性作用呈剂量和时间依赖性，故使用其作为核酸药物载体用于基因治疗研究时，剂量应小于12ul/g体重，每两次给药时间至少间隔1天。 第三部分反义寡聚脱氧核苷酸在HBV转基因小鼠体内的有效剂量及给药方式 目的：探讨反义寡聚脱氧核苷酸（ASODN）在HBV转基因小鼠体内的有效剂量及给药方式。 方法：经尾静脉和腹腔分别给HBV转基因小鼠注射不同剂量的ASODN脂质体混合物，于注射前、注射后第1天、第3天、第7天经眶静脉采血，采用酶联免疫吸附技术检测小鼠血清HBsAg、HBeAg的含量；用PCR基因扩增技术和琼脂糖凝胶电泳技术鉴定小鼠血清中的HBV S片段。 结果：PCR扩增产物在750～1000bp之间；用药后第1d、3d、7d血清HBsAg和HBeAg的抑制率，3ug/g组为22．1％、36．1％、27．9％和54．4％、77．9％、83．8％；6ug/g组为27．5％、40．6％、33．9％和56．2％、77．5％、86．2％；12ug/g组为31．2％、44．1％、28．9％和60．0％、69．3％、84．0％。腹腔注射组血清HBsAg和HBeAg的抑制率均为0．0％。 结论：ASODN对HBV转基因鼠抗病效果存在剂量效应，以6ug/g体重剂量为好。腹腔注射方式无效。 第四部分反义锁核酸在HBV转基因小鼠体内的抗病毒效果及其作用规律 目的：探讨针对乙型肝炎病毒（HBV）S基因的反义LNA对乙型肝炎转基因小鼠HBV复制和表达的影响。 方法：设计合成互补于HBV S基因翻译起始区的反义LNA，与脂质体混合，经尾静脉注入小鼠体内，酶联免疫吸附技术（ELISA）检测血清HBsAg含量；荧光聚合酶链反应（PCR）定量检测血清HBV DNA浓度；免疫组织化学法检测肝脏组织细胞HBsAg、HBcAg的表达；自动血液分析仪检测外周血白细胞数（WBC）、淋巴细胞百分比（LY％）、粒细胞百分比（GR％）、血红蛋白（HGB）、红细胞数（RBC）、红细胞压积（HCT）、平均红细胞体积（MCV）、平均红细胞血红蛋白含量（MCH）、平均红细胞血红蛋白浓度（MCHC）、红细胞分布宽度变异系数（RDW-CV）、血小板数（PLT）、平均血小板体积（MPV）；自动生化分析仪检测血清清蛋白（Alb）、谷丙转氨酶（ALT）、尿素氮（BUN）、肌酐（CR）、肌酸激酶（CK）、肌酸激酶同工酶（CK-MB）、载脂蛋白A1（ApoA1）、载脂蛋白B（ApoB）等指标；小鼠肝脏、肾脏、心脏做常规病理切片HE染色，观察反义LNA对小鼠脏器的影响。 结果：血清HBsAg的表达，注射后第1d、3d、7d、14d、28d，S-ASODN脂质体组抑制率分别为20．3％、31．5％、37．1％、24．1％和15．5％；LNA-脂质体组抑制率分别为41．7％、52．8％、57．8％、30．5％和27．6％。血清HBV DNA的复制，S-ASODN脂质体组对HBV DNA的抑制率分别为2．41％、14．06％、27．44％、18．69％和17．49％；LNA-脂质体组抑制率分别为6．64％、38．538％、40．19％、39．12％和23．58％。小鼠肝细胞HBsAg、HBcAg的表达显著低于对照组。小鼠肝肾功能及组织学未见异常。 结论：针对HBV S基因反义LNA对乙型肝炎病毒转基因鼠HBV复制和表达有显著抑制作用。

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文摘

英文文摘

论文说明：中英文对照词汇表

声明

前 言

第一部分反义寡聚脱氧核苷酸与阳离子脂质体的最适比例及其包裹形式

材料与方法

结 果

讨 论

结 论

第二部分阳离子脂质体作为基因治疗药物载体在小鼠体内的毒性

材料与方法

结 果

讨 论

结 论

第三部分反义寡聚脱氧核苷酸在HBV转基因小鼠体内的有效剂量及给药方式

材料与方法

结 果

讨 论

结 论

第四部分反义锁核酸在HBV转基因小鼠体内的抗病毒效果及其作用规律

材料与方法

结 果

讨 论

结 论

全文小结

展 望

参考文献

综述　慢性乙型肝炎基因治疗微略研究进展

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