缺氧诱导因子-1α的siRNA抑制肝癌细胞生长的实验研究

摘要

原发性肝癌（hepatocellular carcinoma HCC）是我国常见的恶性肿瘤之一，因其起病隐匿，发现时已多属晚期。目前HCC治疗手段有限，手术切除率低，术后复发率高。基因治疗作为一种新癌症的治疗手段，已成为医学研究的方向，其中新兴的RNA干扰（RNAi）技术在基因治疗方面具有较好应用前景。然而，RNAi处于基础实验研究阶段，分子机制目前尚未完全清晰，也未形成一套特异、高效的治疗体系。本实验拟通过实验方法找到针对肝癌细胞缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）的有特异干扰作用的siRNA序列和一套合适有效的RNA干扰策略。为以后进一步实验研究以及基因治疗药物研发提供理论依据。
　　 第一部分：HIF-1α靶向siRNA重组表达载体的构建
　　 目的：利用基因重组技术构建四组HIF-1α靶向siRNA重组表达载体，为后续实验研究提供试验基础。
　　 方法：利用网络资源并按要求设计出四条目的siRNAs并各自插入到载体质粒pGenesil-1.1 中分别为：siRNA1(S1)、siRNA2（S2）、siRNA阴性（SN）、siRNA空白（SB)。经细菌筛选、扩增后运用酶切和基因测序技术检验重组序列是否符合设计要求。
　　 结果：质粒经酶切后两条片段大小均符合设计要求；四个质经粒基因测序验证基因序列完全正确。
　　 结论：HIF-1α靶向siRNA重组表达载体的构建成功。
　　 第二部分：HIF-1α的siRNA重组质粒抑制肝癌细胞的生长
　　 目的：筛选出对肝癌HIF-1α有干扰效果的siRNA序列，为后续实验研究以及基因药物研究提供实验基础。
　　 方法：四组重组载体经脂质体Lipofectamine 2000包埋后转染到缺氧环境的肝癌细胞株bel-7402中。运用RT-PCR检测HIF-1α转录水平以及细胞计数观察肝癌细胞生长受抑制情况。
　　 结果：其中S2组质粒能抑制目的基因HIF-1α的转录，S1、SN、均不能抑制HIF-1α的mRNA转录；其中转染S2组质粒的肝癌细胞生长明显受到抑制，而S1、SN与空白组相比未见肝癌细胞生长受抑制。
　　 结论：本实验筛选出一条特异的siRNA序列（即S2组），该序列的重组载体具有良好的转染效率，其转录产物能成功抑制靶向基因HIF-1α的转录，并抑制了该组肝癌细胞株bel-7402的生长，而S1、SN组均未能有效抑制目的基因的转录，肝癌细胞的生长也未受到抑制。