灰毡毛忍冬(Lonicera macranthoides Hand.-Mazz)中绿原酸生物合成途径及调控技术研究

摘要

灰毡毛忍冬（Lonicera macranthoides Hand.-Mazz），又名山银花，是我国特有的药用植物，在西部地区大面积种植。多酚类化合物是灰毡毛忍冬重要的次生代谢产物，其中绿原酸（CGA）是核心生物活性物质，因此提高绿原酸的产量是亟待解决的问题。近年来，绿原酸的含量、生物合成途径及分子机制成为研究热点。但关于忍冬属植物绿原酸生物合成的分子机理研究报道较少，目前尚未有灰毡毛忍冬中 CGA生物合成途径及调控机制的系统研究。本研究以“渝蕾一号”灰毡毛忍冬为材料，基于不同组织的转录组学数据，鉴定了CGA的生物合成相关的重要功能基因以及调控因子，同时研究了不同生长环境对多酚类化合物，特别是CGA产量的影响。本论文的主要研究结果如下：
　　①利用HPLC技术，对样品前处理、流动相及检测波长作了优化，建立了一种同时检测灰毡毛忍冬绿原酸、阿魏酸、香豆酸、咖啡酸、肉桂酸、芦丁和木犀草苷的方法。基于此方法，对不同花期、叶片及茎段样品中7种多酚类化合物的含量作了检测，结果发现，花中绿原酸含量最高，其次是芦丁和木犀草苷。除香豆酸外，其余6种多酚物质均在不同花期内被检出，7种物质总量在二白期最高，幼蕾期最低。对叶片和茎段而言，嫩叶中绿原酸含量最高，且高于花中绿原酸含量，其次为嫩茎，随着组织老化，绿原酸含量迅速降低，但老叶中木犀草苷含量远高于所有其他组织和发育时期。
　　②利用HPLC检测了绿原酸含量，发现CGA含量在不同的组织间差异显着：幼叶（YL）>幼茎（YS）>成熟花（MF）。通过高通量测序获得灰毡毛忍冬转录组数据，53,533,014个高质量的 reads拼接形成76,453条 unigenes。共有447条unigenes被归类到与绿原酸合成相关的苯丙素生物合成途径。不同组织的RNA-seq结果表明，6831个基因在MF和YL中差异表达，691个基因在3种不同组织中均差异表达。本研究发现了CGA生物合成的两条可能途径，包含苯丙氨酸解氨酶（PAL）、肉桂酸-4-羟化酶（C4H）、4-香豆酸辅酶 A连接酶（4CL）、羟基肉桂转移/羟基肉桂酰辅酶A奎尼酸转移酶（HCT/ HQT）和香豆酸羟化酶（C3H）等重要酶。结合表达量与CGA含量的相关性，推测1个PAL、3个C4H和5个HCT/HQT基因为灰毡毛忍冬中绿原酸生物合成的关键基因；14个差异表达的转录因子（AP2、ERF、MYB、NAC、锌指蛋白）为潜在的绿原酸生物合成的调控因子。
　　③优化了灰毡毛忍冬叶片离体再生体系，在此基础上建立了遗传转化方法；依据转录组数据库中的序列信息，克隆了 LmHQT1基因，生物信息学分析表明LmHQT1与NsHQT和SlHQT高度同源；qRT-PCR结果表明，LmHQT1在幼叶中表达量最高，显著高于其它组织，这与绿原酸含量结果一致；为了深入研究基因的功能，构建了LmHQT1基因超表达载体并转化灰毡毛忍冬，结果发现，转基因植株中的绿原酸含量提高了约60％。
　　④研究了不同光质处理对灰毡毛忍冬生长及光合作用的影响，发现红光下植株长势、生物量、茎生长及光合指标（净光合速率、胞间二氧化碳浓度、蒸腾速率和气孔导度）均达到最高，表明红光促进植株生长和光合作用；研究了培养基上的不同激素配比对植株生长和次生代谢物积累的影响，筛选了最佳生长培养基（MB+1.0mg/L BA+1.0mg/L IBA）和最佳代谢培养基（MB+2.0mg/L BA+0.2mg/L IBA）；研究了不同的激素配比与光质组合对次生代谢物积累的影响，结果发现，在最佳代谢培养基上，红光最有利于酚类物质积累，白光则不利于积累；在最佳生长培养基上，白光和蓝光最有利于酚类物质的积累，绿光则不利于酚类积累。
　　综上，该研究基于转录组学分析鉴定了灰毡毛忍冬绿原酸生物合成途径的重要功能基因和调控因子；系统建立了遗传转化技术体系，并对关键基因HQT进行了功能分析；探索了不同的培养条件对多酚物质特别是绿原酸积累的调控；为阐明灰毡毛忍冬中绿原酸生物合成的主要途径及调控机制提供了重要参考。

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缩略词列表

1 绪 论

1.1 灰毡毛忍冬概述

1.2 植物多酚类化合物

1.3植物绿原酸相关的研究进展

1.4 植物中次生代谢产物积累的调控

1.5 本论文工作设想

2 灰毡毛忍冬多酚类物质检测方法的建立

2.1 引言

2.2 材料与方法

2.3 结果与分析

2.4 结论

3 灰毡毛忍冬绿原酸生物合成途径转录组及表达谱分析

3.1 引言

3.2 材料与方法

3.3 结果与分析

3.4 讨论

3.5 小结

4 灰毡毛忍冬遗传转化体系建立及LmHQT1转基因鉴定

4.1 引言

4.2 材料与方法

4.3 结果

4.4 讨论

4.5 小结

5 不同光质对灰毡毛忍冬生长发育及酚酸产量的影响

5.1 引言

5.2 材料与方法

5.3 研究结果

5.4讨论

6 结论与展望

6.1主要结论

6.2本研究的创新点

6.3后续工作展望

致谢

参考文献

附录

A. 作者在攻读博士学位期间发表的论文（*为通讯作者）

B. 作者在攻读博士学位期间获得的国家发明专利

C. 作者在攻读博士学位期间获得的成果奖

D. 作者在攻读博士学位期间参加的科研项目

E. 本文所用到的附录文件