贯叶金丝桃活性成分的高速逆流色谱分离纯化方法研究

摘要

中药贯叶金丝桃是极具开发潜力的天然药物，具有清热解毒、抗菌消炎、消肿止血、利湿止痛等中医功效，以及抗抑郁、抗病毒、抗癌、抗菌、镇痛等药理活性。其化学成分金丝桃素、贯叶金丝桃素、金丝桃苷等被认为是发挥药理活性的主要成分，其中，贯叶金丝桃素被认为是抗抑郁的主要活性成分；金丝桃素在抗病毒和抗肿瘤等方面作用显著；金丝桃苷具有明显的抗炎、止咳、镇痛等作用。这些化学成分被用于相关药物的质量控制和进一步的新药开发，具有重要的研究价值。 贯叶金丝桃活性成分的提取纯化难度很大。虽然贯叶金丝桃中有效成分的活性较高，但在植物中甚至是市售的粗提物中含量都很低，这给活性成分的进一步分离纯化带来很大的困难；另外，贯叶金丝桃素和金丝桃素都属于光敏性、热不稳定物质，在遇光和遇热情况下较易发生变化而氧化及失活，这也是这些成分提取困难，提取物中含量较低的原因之一。目前国内外对贯叶金丝桃分离提取，尤其是精制高纯度单体的研究很少。 本论文采用高速逆流色谱法(HSCCC)分离纯化贯叶金丝桃中的贯叶金丝桃素、贯叶金丝桃素氧化物、金丝桃素、黄酮类物质(包括金丝桃苷和一种未知物质)等五种活性成分，研究内容主要包括以下方面： 1．建立五种成分的HPLC分析方法。对于金丝桃素的分析难度较大，实验时购买了金丝桃素对照品；对于没有对照品的贯叶金丝桃素、黄酮类物质等，主要利用HPLC—DAD、HPLC—MS、UV等方法，最终确定了其HPLC分析方法。所建立五种物质的HPLC分析方法包括等比例洗脱和梯度洗脱方式，用到的试剂主要包括甲醇、乙腈、四氢呋喃、水等。这就为为贯叶金丝桃活性成分分离提取和质量控制提供了基础。 2．建立了贯叶金丝桃的粗提取方法。根据相似相溶原理，选择不同极性的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇溶剂依次对市购粗提物粉末进行提取，通过单因素考察法对萃取法、溶剂加热回流法、溶剂超声提取法进行考察，最后选择了选择最适合的粗提取方法即溶剂超声提取法。 3．分别建立五种成分高纯度单体的 HSCCC 分离纯化方法，包括溶剂体系的筛选、分离条件的选择优化和样品的分离。使用逆流色谱的方法，从石油醚超声提取物A中纯化出贯叶金丝桃素(HF)单体和贯叶金丝桃素氧化产物(HF')单体；从乙酸乙酯超声提取物B中纯化出金丝桃素(HR)单体；从正丁醇超声提取物C中纯化出金丝桃苷(HS)单体和一种未知单体成分(HS—5)单体。 4．对分离所得五种单体成分进行了进一步的结构鉴定，采用了包括紫外可见光谱分析、液质联用分析、核磁共振分析等方法。 5．用已建立的方法制备出一定量高纯度的五种成分单体，以便进一步结构鉴定和进行稳定性研究。 本课题所建立的高速逆流色谱分离纯化贯叶金丝桃活性成分的方法，填补了目前国内外相关领域研究的空白；经国内外文献检索，其中只有金丝桃苷有1篇相关报道，其它成分的HSCCC分离均属首次报道。用高速逆流色谱制备出贯叶金丝桃活性成分的高纯度对照品，即可用于相关产品的质量控制，也可用于药理活性的进一步研究，因此，本课题的研究工作具有一定的学术和实用价值。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一章 绪论

1.1贯叶金丝桃简介

1.1.1贯叶金丝桃及其资源分布

1.1.2贯叶金丝桃的主要化学成分

1.1.3贯叶金丝桃的药理作用

1.2国内外研究现状

1.2.1金丝桃素提取分离方法

1.2.2贯叶金丝桃素提取分离方法

1.2.3金丝桃苷提取分离方法

1.2.4活性成分的分析方法

1.3高速逆流色谱法(HSCCC)简介

1.3.1高速逆流色谱分离机理

1.3.2高速逆流色谱工作方法

1.3.3高速逆流色谱的优点

1.4本课题的研究目的、内容及意义

1.4.1研究目的

1.4.2研究内容

1.4.3选题的意义

第二章 贯叶金丝桃活性成分的提取方法

2.1实验部分

2.1.1主要原料试剂

2.1.2实验仪器设备

2.1.3实验方法

2.2结果与讨论

2.2.1萃取法

2.2.2加热回流法

2.2.3超声提取法

2.3结论

第三章 HSCCC分离纯化贯叶金丝桃素方法研究

3.1实验部分

3.1.1主要原料试剂

3.1.2实验仪器设备

3.1.3实验方法

3.2结果与讨论

3.2.1贯叶金丝桃素分析方法的建立

3.2.2 HSCCC溶剂体系选择

3.2.3 HSCCC分离纯化贯叶金丝桃素

3.2.4贯叶金丝桃素结构分析

3.3结论

第四章 HSCCC分离纯化贯叶金丝桃素氧化物HF'方法研究

4.1实验部分

4.1.1主要原料试剂

4.1.2实验仪器设备

4.1.3实验方法

4.2结果与讨论

4.2.1 HF'分析方法的建立

4.2.2 HSCCC溶剂体系选择

4.2.3 HSCCC分离纯化HF'

4.2.4 HF'结构分析

4.3结论

第五章 HSCCC分离纯化金丝桃素方法研究

5.1实验部分

5.1.1主要原料试剂

5.1.2实验仪器设备

5.1.3实验方法

5.2结果与讨论

5.2.1 HPLC色谱条件的选择

5.2.2 HSCCC溶剂体系的选择

5.2.3 HSCCC分离纯化金丝桃素

5.2.4金丝桃素对比分析

5.3结论

第六章 HSCCC分离纯化黄酮类成分方法研究

6.1实验部分

6.1.1主要原料试剂

6.1.2实验仪器设备

6.1.3实验方法

6.2结果与讨论

6.2.1金丝桃苷分析方法的建立

6.2.2 HSCCC溶剂体系选择

6.2.3 HSCCC分离纯化黄酮类物质

6.2.4 HS-5和HS-8结构鉴定

6.3结论

第七章 结论、创新点与展望

7.1主要结论

7.2本论文创新点

7.3后续研究工作的展望

参考文献

附录

成果清单

致谢