人骨髓间充质干细胞对间质性肺纤维化的抗损伤治疗机制及黄酮化合物的协同效应

摘要

研究背景和目的: 间质性肺疾病（ILD)：是由各种不同原因引起的累及肺间质、肺泡、细支气管的肺部弥漫性疾病,其以非特异性肺泡炎伴肺间质纤维化为共同病理改变，具有类似的临床、呼吸病理生理学和胸部X线特征。由于环境因素与城市化的进程，近年来这类疾病呈显著上升趋势，因发病机制不甚清楚，迄今为止尚无有效的治疗药物与方法，其中发病率较高的特发性肺纤维化5年生存率仅为25％。近来更多的实验和临床研究结果表明，肺泡损伤修复障碍引起异常修复，是肺间质纤维化的主要发病机制。其中，在疾病的早期，自身免疫功能紊乱失衡在肺间质纤维化的发生发展中具有重要地位。相关研究表明，在致纤维化动物模型以及患者肺内，损伤的肺组织中有大量淋巴细胞浸润，其中含有高比例的具有自身免疫杀伤活性的NKT细胞。NKT细胞是一群独特的T细胞亚群,它们除了表达T细胞的标志外,也能表达NK细胞的标志，CD3+CD56+是NKT细胞的主要表型，它们通过细胞毒与产生细胞因子INF-γ的作用成为固有免疫和获得性免疫中发挥关键作用的一类免疫炎症细胞。NKT细胞通过分泌炎性细胞因子及直接杀伤作用，对肺上皮细胞造成损伤。因此在肺间质纤维化发病早期，调节异常的自身免疫炎症与促进功能性肺上皮细胞修复的抗损伤治疗，可能是有效控制肺间质纤维化进展的关键环节。 间充质干细胞由于它特殊的免疫学特征诸如低免疫原性和免疫调节功能，可能通过多靶点对免疫细胞亚群进行调节从而逆转自身免疫应答的紊乱，其多向分化的潜能有助于损伤肺泡结构的修复，为间质性肺纤维化的治疗带来了希望的曙光。但是，由于间充质干细胞在间质肺炎－如NSIP/IPF患者肺内复杂的炎症微环境下的分化趋向并不清楚，因其在不同微环境下既可能分化为肺上皮细胞也有可能向成肌纤维母细胞分化。间充质干细胞对机体成纤维细胞的作用，尤其是对这些病人发生病变的成纤维细胞的作用如何，是保护性抗炎作用还是促进纤维化的发展，不同学者意见并不统一。 黄酮是一类以苯色酮环为基础的酚类化合物，可以抑制多种炎性生物酶的渗出，促进损伤的细胞增殖和修复，发挥抗损伤作用。具有抗炎调节免疫作用的中药验方通常含有多种黄酮化合物。 因此，本课题通过体外诱导的NKT细胞，模拟间质性肺纤维化炎症损伤特点，探讨了骨髓间充质干细胞的免疫调节抗炎及其保护肺上皮细胞的抗损伤机制，调查了骨髓间充质干细胞对NSIP患者异常的肺成纤维细胞的影响，同时探索了中药经验方中总黄酮提取物可能的协同效应，为临床间质肺纤维化的治疗开拓新的思路和途径。 研究内容和方法: 第一部分：人骨髓间充质干细胞的培养鉴定与在小鼠肺内的定殖 全骨髓培养法分离人2～3月龄流产胎儿骨髓间充质干细胞（Bone marrow mesenchymal stem cells BMMSCs），并进行细胞表型鉴定。调整合适的间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)培养密度，转染(green fluorescent protein,GFP)绿色荧光蛋白真核表达质粒－PEGFPn2。取转染GFP质粒表达绿色荧光蛋白的间充质干细胞（1×106/只）经尾静脉注入SCID小鼠体内，MSCs注入小鼠体内24小时内处死小鼠，冰冻切片，共聚焦激光显微镜下观察。 第二部分：人骨髓间充质干细胞对体外培养NKT细胞的诱导调节作用 NKT细胞的体外培养：取正常人外周血，以淋巴细胞分离液分离外周血单个核细胞（peripheral blood monouclear cells，PBMC)，以IFN-γ、CD3、IL-2刺激培养21天，得到含高比例CD3+CD56+NKT细胞的PBMC，将这种培养的CD3+CD56+NKT细胞与人骨髓间充质干细胞MSCs或人成纤维细胞(human fibroblasts,HFBs) 20:1共培养24小时，留取培养基上清液，流式细胞仪鉴定NKT表型。实验分NKT组，MSC-NKT共培养组和HFB-NKT共培养组。 用ELISA 方法检测TGF-β1和IP-10细胞因子水平，并用液相芯片技术检测共培养上清中IFN-γ、TNF-α等炎性因子水平，实验分NKT组，MSC-NKT共培养组和HFB-NKT共培养组。 第三部分：人骨髓间充质干细胞对NSIP患者肺成纤维细胞的作用 人骨髓间充质干细胞与NSIP患者肺成纤维细胞以Transwell孔共培养，共培养24小时留取上清，ELISA测定用ELISA 方法检测TGF-β1和IP-10细胞因子水平，并用液相芯片技术检测共培养上清中IL-6、IL-8、MCP-1等炎性因子水平。 Transwell孔共培养48小时后提取NSIP肺成纤维细胞蛋白，western blotting检测NSIP患者肺成纤维细胞分泌的α-SMA平滑肌肌动蛋白的表达水平。 第四部分：人骨髓间充质干细胞联合中药验方总黄酮提取物对NKT介导的肺上皮细胞杀伤的防护效应。 不同浓度总黄酮对16HBE的增殖作用，取对数生长期的靶细胞16HBE人支气管上皮细胞96孔培养板接种，细胞贴壁后加入不同浓度的中药验方总黄酮提取物（从12.5ug/ml至200ug/ml），孵箱内培养24小时，以CCK8法检检测16HBE细胞增殖率。 CD3+CD56+NKT与人骨髓间充质干细胞MSC或人成纤维HFB 20:1共作用24小时，再与16HBE共作用4小时，以CCK8法检测16HBE细胞活率，测定各组NKT细胞杀伤活性的改变，实验分为NKT-16HBE组、HFB-NKT-16HBE组和MSC-NKT-16HBE组。 MSC联合中药验方总黄酮提取物对NKT杀伤肺上皮的协同影响，16HBE 以1×104/孔密度96孔板接种，NKT与MSC细胞20:1共作用24小时，取NKT细胞及与MSC共培养后的NKT细胞与16HBE在无血清AIM-V培养基中共培养4小时（分为有黄酮组25ug/ml和无黄酮组）。换新鲜培养基，16HBE继续在有黄酮25ug/ml或者无黄酮的AIM-V培养基中再培养8小时，观测NKT组、NKT-黄酮组、MSC-NKT组、MSC-NKT-黄酮组对16HBE的作用，CCK8法观测16HBE杀伤后增殖率变化。 结果: 经流式细胞仪分析鉴定证实我们成功培养了人骨髓间充质干细胞。应用P6代间充质干细胞转染绿色荧光蛋白GFP质粒，转染效率稳定在40%左右。转染绿色荧光蛋白GFP质粒MSC注入SCID小鼠体内6～18小时取肺制备病理切片，可检测到定植在肺与气道上皮的MSC。 体外培养可见间充质干细胞对CD3+CD56+NKT细胞比率有明显下调作用，对照组NKT为(20.33±1.05％)，而MSC作用过的NKT为(15.17±1.75％，P＜0.05)。而正常人成纤维细胞HFB作用过的NKT为(19.93±1.64，p＞0.05)，与对照组无显著差异。同时，我们也发现，间充质干细胞MSC可以下调NKT细胞培养中总体PBMC中所含CD3+CD8+T细胞比例，对照组CD3+CD8+T细胞(70.37±1.44％)，MSC作用组CD3+CD8+T细胞(66.93±1.69％、P＜0.05)，HFB作用组CD3+CD8+T细胞（69.97±2.23，p＞0.05）与对照组无明显差异；与此同时上调了所含的CD3+CD4+T细胞比例，对照组CD3+CD4+T细胞(24.66±1.40％)，MSC作用组CD3+CD4+T细胞(29.75±1.80％、P＜0.05)，HFB作用组CD3+CD4+T细胞（25.32±1.06％，p＞0.05）与对照组无明显差异；我们还发现，MSC可以上调培养中调节性T细胞的比例，对照组调节性T细胞（19.63±1.38％），MSC作用组调节性T细胞（24.50±1.98，P＜0.05），HFB作用组调节性T细胞（19.17±1.06，p＞0.05）与对照组无明显差异。MSC具有多向免疫调节作用与其能产生高水平的TGF-β1及IP-10有关（分别为：22.45±3.37pg/ml，238.36±19.24pg/ml 与21.38±3.97pg/ml）P＜0.01。（51.23±2.45pg/ml，1512.92±149.72pg/ml，49.78±6.55pg/ml）P＜0.01，能够下调免疫损伤相关的IFN-γ、TNF-α等炎性因子水平。 人骨髓间充质干细胞与NSIP患者肺成纤维细胞Transwell孔共培养实验中，我们发现TGF-β1及IP-10高表达，NSIP组、MSC-NSIP组、HFB-NSIP组TGF-β1值分别为：(39.44±3.67 pg/ml，154.13±11.72 pg/ml，41.23±7.27）。IP-10值分别为：(32.78±4.51pg/ml，67.43±8.91pg/ml，34.63±6.87），人骨髓间充质干细胞能显著下调NSIP肺成纤维细胞分泌的IL-6、IL-8和 MCP-1炎性细胞因子水平。人骨髓间充质干细胞能够明显下调NSIP患者肺成纤维细胞显著增加的α-SMA平滑肌肌动蛋白的表达，能够抑制肌纤维母细胞的产生与活化，阻断纤维化的进行性发生发展。 间充质干细胞降低了NKT细胞对16HBE细胞的杀伤率。对照组NKT对16HBE细胞的杀伤率为（36.05±5.63％），MSC调节组对16HBE细胞的杀伤率下降至（25.87±4.12％、P＜0.05），HFB作用组与对照无明显差别（34.64±5.81％，p＞0.05）。 取NKT及MSC作用后的NKT细胞 与16HBE分别在有黄酮25ug/ml或者无黄酮的AIM-V培养基中共培养4小时。换取上清，16HBE继续在有黄酮25ug或者无黄酮的无血清培养基中再培养8小时，观测NKT组、NKT-黄酮组、MSC-NKT组、MSC-NKT-黄酮组对16HBE杀伤率分别是（30.57±3.63％，25.84±3.01％，22.63±2.12％，15.21±1.39％）。NKT-16HBE组、NKT-黄酮-16HBE-组、MSC-NKT-16HBE-组、MSC-NKT-黄酮-16HBE组，各组TGF-β1值分别为（45.72±5.18 pg/ml，33.21±2.94 pg/ml，201.34±18.11pg/ml，157.73±14.61pg/ml）。IP-10值分别为（34.83±2.96pg/ml，35.14±4.19 pg/ml,568.30±47.64pg/ml，571.43±48.66pg/ml）。MSC协同低剂量总黄酮显著抑制了NKT对16HBE细胞的杀伤作用。MSC这种保护作用与其产生高水平的TGF-β1和IP-10有关，而总黄酮能抑制TGF-β1值的过度表达，总黄酮对IP-10值无明显抑制作用。 结论: 1、间充质干细胞具有低免疫原性，可以在异体肺内定殖从而发挥免疫调节功能。 2、间充质干细胞对于包括NKT细胞在内的多种T淋巴细胞亚群具有免疫调节作用，能够降低PBMC中高比例的NKT细胞，诱导调节性T细胞的分化，下调IFN-γ、TNF-α等多种炎性因子水平。能够分泌高水平的TGF-β1及IP-10是其具有免疫调节作用的重要分子基础。 3、 间充质干细胞能够下调NSIP肺成纤维细胞高水平分泌的多种炎性细胞因子，抑制NSIP患者肺成纤维细胞的α-SMA平滑肌肌动蛋白的高表达，具有阻断异常修复与防治进行性纤维化发展的临床应用意义与价值。 4、 间充质干细胞联合低剂量总黄酮化合物对NKT杀伤肺上皮细胞具有协同保护作用；经方总黄酮提取物对肺上皮细胞有抗损伤促增殖作用，同时能够减少TGF-β1的生成释放，有助于避免TGF-β1持续性过度分泌而促进纤维化的发生，可能是黄酮类化合物在肺损伤治疗中发挥与MSC协同作用的重要机制。

目录

文摘

英文文摘

论文说明:中英文缩略语词汇对照表

声明

前言

第一部分 人骨髓间充质干细胞培养鉴定与在小鼠肺内的定殖研究

第二部分 人骨髓间充质干细胞对体外培养NKT细胞的诱导调节作用

第三部分 人骨髓间充质干细胞对NSIP患者肺成纤维细胞的作用

第四部分 人骨髓间充质干细胞联合中药验方总黄酮提取物对NKT杀伤肺上皮细胞的抗损伤保护效应

全文结论

附图

参考文献

综述 间充质干细胞对肺间质纤维化治疗的研究进展

致谢