舟山眼镜蛇细胞毒素CTX1抗肿瘤作用及机制

摘要

背景与目的: 化疗药物耐药情况普遍存在是临床抗肿瘤用药的一大难题。生物毒素为临床抗肿瘤治疗提供了新的思路。眼镜蛇毒细胞毒素又称心脏毒素，是从眼镜蛇毒中分离出的毒性蛋白，对多种肿瘤细胞有选择性杀伤作用，在蛇毒抗肿瘤研究中占重要地位。目前研究表明它可通过细胞膜作用、线粒体途径或者溶酶体等途径发挥作用。舟山眼镜蛇细胞毒素CTX1是本课题组从舟山眼镜蛇毒中分离纯化的小分子多肽，CTX1抗肿瘤作用目前未见文献报道，本实验拟研究CTX1的抗肿瘤作用及相关作用机制。研究内容包括：1、CTX1对体外细胞株相对活力和P388腹水瘤小鼠生存期的影响。2、CTX1对肿瘤细胞死亡的影响。3、CTX1对线粒体膜通透性和凋亡蛋白Caspase 8、Caspase9的影响。4、CTX1对溶酶体膜通透性和组织蛋白酶B（Cathepsin B）的影响。5、Caspase家族广谱抑制剂Z-VAD-FMK和Cathepsin B抑制剂CA-074 Me对CTX1诱导的肿瘤细胞死亡的影响。 实验方法: 1 CTX1抗肿瘤作用评价 1.1 细胞相对活力测定：MTS法检测CTX1对多种细胞（MCF-7、H22、K562、P388和16HBE）相对活力的影响。 1.2 P388腹水瘤昆明小鼠生存期评价 2 CTX1对肿瘤细胞死亡的影响 2.1 流式细胞术检测Annexin V-FITC、PI双染后细胞死亡情况。 2.2 荧光显微术观察活细胞培养体系细胞死亡情况（MCF-7细胞：Annexin V-FITC、PI双染；K562细胞：PI染色）。 2.3 乳酸脱氢酶（LDH）活力检测 3 线粒体膜电位检测：Rhodamine 123染色后用流式细胞仪检测细胞荧光强度。 4 CTX1对溶酶体膜通透性和Cathepsin B活性的影响 4.1 溶酶体特异性染色：LysoTracker Red DND-99或LysoTracker Green DND-26染色后于荧光显微镜或激光共聚焦显微镜下观察。 4.2 Cathepsin B活性检测：根据Cathepsin B 活性检测试剂盒处理后于全波长多功能读数仪检测。 5 Western blotting检测相关蛋白（GAPDH、Caspase 8、Caspase 9、Cathepsin B）表达水平。 结果： 1.CTX1对体外细胞株相对活力和P388腹水瘤小鼠生存期的影响 1.1用MTS 方法检测细胞相对活力：CTX1对多种细胞（MCF-7、H22、K562、P388和16HBE）的活力具有抑制作用，并呈现剂量依赖和时间依赖关系。与肿瘤细胞株相比，CTX1对人支气管上皮细胞株16HBE活力的抑制作用较弱，这说明CTX1对肿瘤细胞株有选择性抑制作用。CTX1对多种肿瘤细胞株的半数抑制浓度(IC50)不同，说明CTX1对不同肿瘤细胞株具有选择性抑制作用。 1.2 CTX1（1/3LD50，1.40 mg/kg/day）可明显延长P388腹水瘤小鼠的生存期及累积生存率，与阴性对照组相比具有统计学差异（P<0.05）。 2.CTX1对肿瘤细胞死亡的影响 2.1流式细胞术检测细胞死亡发现，CTX1诱导肿瘤细胞 （K562、P388）死亡，呈现剂量依赖和时间依赖关系，主要引起细胞晚期凋亡和坏死，早期凋亡均不明显。 2.2荧光显微术观察细胞死亡：K562或者MCF-7对照组绝大部分细胞大小正常，胞膜光滑，状态良好，未被PI染色。随着CTX1浓度增加和作用时间延长，PI染色的细胞数（即死亡细胞）明显增多。在MCF-7实验中，CTX1处理过的细胞基本未被Annexin V-FITC染色，说明CTX1并不诱导早期凋亡。 2.3随着CTX1浓度增加，P388细胞培养体系中LDH活力逐渐增加。 3 CTX1对线粒体膜通透性和凋亡蛋白Caspase 8、Caspase9的影响 3.1 CTX1导致线粒体膜电位丢失：P388细胞经罗丹明123染色后用流式细胞仪检测，CTX1（1、2、4 μg/ml）处理组荧光强度较对照组明显减弱，低荧光强度的P388细胞所占百分率随着CTX1剂量的增加而增加（P<0.05）。 3.2 Western blotting检测结果显示：CTX1未引起GAPDH、Caspase 8、Caspase 9蛋白表达的明显变化。 4 CTX1对溶酶体膜通透性和Cathepsin B的影响 4.1 溶酶体染色后可见CTX1处理组MCF-7或P388细胞荧光强度较阴性对照组减弱，反映了溶酶体膜完整性丢失。CTX1诱导溶酶体膜通透性增加（LMP）。 4.2 CTX1引起Cathepsin B活性增加：加药处理P388细胞12 h，溶剂对照组、BSA（4 μg/ml）组、CTX1（2、4 μg/ml）各组CB活性（A.U./mg of protein）分别为：（8.49±0.18）、（8.09±0.14）、（25.83±2.54）、（25.17±4.25），CTX1处理组酶活性约为溶剂对照组酶活性的3倍。CTX1组与溶剂对照组相比有显著性差异（P<0.05）。 4.3 Western blotting检测结果显示：CTX1未引起Cathepsin B蛋白表达的明显变化。 5 Z-VAD-FMK和CA-074 Me对CTX1诱导的肿瘤细胞死亡的影响 5.1 应用Z-VAD-FMK(10 μM)和CA-074 Me (7.5 μM)预处理P388细胞1小时，再分别用CTX1（4 μg/ml）处理12 h，MTS法检测细胞相对活力，结果显示：Z-VAD-FMK和CA-074 Me均能增加CTX1作用后的P388细胞相对活力。 5.2 细胞处理同5.1，流式细胞术检测Annexin V-FITC、PI双染后P388细胞死亡情况，结果显示：Z-VAD-FMK和CA-074 Me均能减少CTX1作用后的P388细胞死亡。 5.3 细胞处理同5.1，荧光显微镜术观察细胞死亡结果显示：CA-074 Me能减少CTX1作用后的MCF-7细胞死亡，Z-VAD-FMK不能减少CTX1作用后的MCF-7细胞死亡。 结论： 1 CTX1具有体内外抗肿瘤作用，对不同肿瘤细胞具有选择性抑制作用，该作用呈剂量依赖和时间依赖关系。 2 CTX1诱导肿瘤细胞发生凋亡和坏死。 3 CTX1主要引起肿瘤细胞坏死，可能的机制包括溶酶体膜的通透化和Cathepsin B的激活。

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