血管相关迁移细胞蛋白调控血管新生及血管平滑肌细胞迁移

摘要

血管新生是在已有血管的基础上长出新的血管并形成血管网络的生物学过程，涉及到细胞的增殖、迁移、管腔形成、血管成熟和血管重构等一系列过程，这一事件是多种细胞、生长因子、细胞外基质共同参与的一个复杂过程，多种信号分子和信号途径参与其中。VSMCs的表型转化及增殖和迁移是血管损伤后或动脉粥样硬化斑块发生过程中的内膜过度增生的重要原因，导致这一事件的诱导因素有炎症反应、机械损伤、氧化应激等，其中氧化应激因素非常重要。Ox-LDL是促进VSMCs增殖和迁移的主要氧化应激因子之一。
　　过去的研究表明，AAMP是一个与细胞迁移有关的蛋白，这意味着 AAMP可能具有促血管新生的特性。但AAMP到底会不会参与血管新生过程，目前还缺乏体内外的实验证据。另外，AAMP和ox-LDL都在内膜增生的过程中有重要作用，但AAMP是否在ox-LDL促进的VSMCs迁移中起作用尚不明确。因此，本研究旨在明确AAMP蛋白在血管新生和VSMCs迁移过程中的作用及其分子机制。通过构建AAMP高表达和干扰表达载体，结合多种细胞分子生物学的实验技术方法研究AAMP调控血管新生和VSMCs迁移及具体的细胞分子生物学机制。本论文的主要研究内容和结论如下：
　　1）首先，通过生物信息学软件分析预测了AAMP的基因和蛋白结构。主要研究结论如下：AAMP是一个在进化上非常保守的蛋白，不同物种的AAMP蛋白一级结构差异较小，有大量保守的结构基序。人AAMP基因位于第2号染色体的长臂上，由10个内含子和11个外显子构成。AAMP蛋白中有8个WD40结构域，三维结构预测显示AAMP蛋白可以形成一个螺旋桨样的三维结构。并且AAMP可能与NOD1、CDC20等蛋白相互作用。
　　2）然后，实验研究了AAMP的表达模式和对血管新生的作用。实验通过蛋白免疫印迹、细胞免疫荧光及反转录RCR技术研究了AAMP在正常细胞、癌细胞、小鼠多种组织中的表达情况。研究结果发现，AAMP在正常的组织细胞中和癌细胞中都有表达，并且大部分的AAMP都定位于细胞的胞浆区域。AAMP在小鼠多种组织器官中都有表达，具有丰富微血管结构并且代谢比较旺盛的组织中 AAMP的表达较高。通过构建小鼠后肢缺血的血管新生模型发现，AAMP在缺血诱导的组织中表达量增加，因此AAMP可能参与血管新生过程。构建针对AAMP的干扰RNA表达载体研究AAMP对血管新生的调控作用，发现在HUVECs中干扰AAMP的表达后内皮细胞在三维基质上的管腔形成能力减弱。并且AAMP的特异性抗体抑制AAMP的功能后血管环出芽性血管新生减少。总之，AAMP在血管新生的过程中表达升高，AAMP主要通过调控内皮出芽和管腔形成调控血管新生。
　　3）接下来，对AAMP调控血管新生的细胞分子机制进行了详细研究。通过构建带FLAG标签的AAMP真核表达载体，并用anti-FLAG抗体和anti-AAMP抗体进行细胞免疫荧光染色，发现在HUVECs中外源性和内源性的AAMP都主要定位于胞浆，并且在细胞膜上也有分布；在EA.hy926细胞中，AAMP也主要位于细胞质中。研究发现，VEGF可以促进AAMP的表达，并且VEGF可以促进AAMP向细胞膜上的转移，尤其在细胞边缘的突起部分AAMP蛋白聚集较多。但干扰AAMP的表达不利于细胞膜突起结构的形成，并且会造成细胞边缘膜结构上的AAMP蛋白含量降低。研究还发现AAMP通过调控细胞迁移、细胞粘附和铺展参与血管新生。干扰AAMP的表达后抑制血管内皮细胞的迁移，细胞粘附能力减弱，细胞粘附后的铺展面积减小，细胞内应力纤维束减少，细胞的收缩能力变弱。进一步的研究发现，RhoA/ROCK信号参与AAMP调控的血管新生。干扰AAMP表达或抗体抑制AAMP后抑制了RhoA向细胞膜的转移；RhoA/ROCK抑制剂Y27632抑制血管内皮细胞的血管新生活性。通过构建AAMP的高表达载体在HUVECs中高表达AAMP后发现，高表达外源性AAMP可以促进内皮细胞的迁移、细胞骨架应力纤维的形成及细胞收缩并促进管腔形成，但不能挽救Y27632对血管新生的抑制效应。因此，AAMP可以促进RhoA/ROCK信号的激活，因此RhoA/ROCK信号是AAMP的下游信号分子。
　　4）由于PPARγ信号的激活可以抑制细胞迁移和AAMP的表达。但PPARγ信号活化后对AAMP调控的血管新生的影响还不知道。本实验进一步研究了罗格列酮（RSG）激活的PPARγ信号可以负调控AAMP促进的血管新生。PPARγ激动剂RSG既可以抑制血管内皮细胞管腔形成，也可以抑制主动脉环出芽性血管新生；PPARγ的拮抗剂 GW9662预处理后可以显著减弱 RSG对血管新生的抑制作用。RSG既可以抑制内皮细胞的迁移，也可以抑制内皮细胞的增殖，但PPARγ拮抗剂GW9662预处理则会解除RSG对细胞迁移和增殖的抑制作用。因此，RSG抑制血管新生是通过抑制内皮细胞的迁移和增殖起作用的，并且这一过程可能依赖于PPARγ。进一步研究发现，RSG可以抑制 AAMP的表达，但 GW9662可以解除RGS对AAMP表达的抑制作用。RSG还可以促进PPARγ的表达升高并向细胞核内的转移。这进一步证明，RSG抑制AAMP表达通过PPARγ起作用。AAMP高表达可以缓解RSG对血管内皮细胞迁移和管腔形成的抑制，但不能回救对细胞增殖的抑制。因此，RSG抑制细胞迁移和血管新生在一定程度上是通过促进PPARγ的表达和向细胞核内的转移从而抑制AAMP蛋白表达来实现的。进一步的研究发现，p53信号介导RSG对AAMP表达和血管新生的抑制。RSG可以促进p53的表达上调和向细胞核内的转移，抑制p53的活性后AAMP的表达增加。RSG可以抑制VEGF诱导的AAMP向细胞膜上的转移，但GW9662和p53抑制剂Pifithrin-α则会缓解RSG的这种抑制作用。因此，RSG抑制AAMP向细胞膜上的转移与PPARγ信号的激活和p53的表达上调相关。Pifithrin-α可以减弱RSG对内皮细胞迁移、管腔形成和三维基质中培养的主动脉环的出芽性血管新生的抑制。
　　5)此外，由于ox-LDL和VSMCs的迁移在动脉粥样硬化病理过程中的重要作用，实验还研究了不同浓度的ox-LDL对VSMCs的迁移和AAMP表达的影响，并研究了AAMP参与ox-LDL调控的VSMCs迁移的机制。实验研究发现，较低浓度（12.5μg/ml、25μg/ml、50μg/ml）的ox-LDL可以促进VSMCs的迁移，而高浓度（100μg/ml）的ox-LDL则诱导VSMCs的凋亡。较低浓度（12.5μg/ml、25μg/ml、50μg/ml）的ox-LDL可以促进 VSMCs对脂质的吸收和脂质积累，而较高浓度（100μg/ml）的ox-LDL则会抑制VSMCs对脂质的吸收和胞内脂质积累。低浓度（25μg/ml）的ox-LDL可以诱导AAMP的表达和小G蛋白Rac I和RhoA向细胞膜的转移，而较高浓度（100μg/ml）的ox-LDL刺激条件下 AAMP的表达无显著变化。干扰AAMP的表达可以抑制25μg/ml的ox-LDL诱导的RhoA向细胞膜的转移和细胞迁移。进一步的研究发现，整合素β3可以通过促进RhoA信号的活化来促进VSMCs的迁移，并且这一过程与AAMP向细胞膜上的转移有关。总之，较低浓度的ox-LDL可以促进AAMP的表达，AAMP通过促进RhoA向细胞膜转移促进细胞迁移，并且整合素β3可以通过促进 RhoA信号的活化来促进 VSMCs的迁移。
　　综上所述，通过本研究的一系列研究工作我们明确了 AAMP在血管新生和ox-LDL促进VSMCs迁移中的作用。首先，AAMP可以促进血管新生。AAMP既可以促进内皮出芽、也可以促进管腔形成，AAMP调控血管新生主要通过调控内皮细胞迁移起作用。AAMP通过PPARγ-p53-AAMP-RhoA/ROCK信号通路调控细胞迁移和血管新生过程。另外，AAMP参与较低浓度的ox-LDL诱导的VSMCs迁移。较低浓度的ox-LDL可以诱导AAMP的表达和RhoA向细胞膜的转移，RhoA的膜转移和活化依赖于 AAMP，并且整合素β3也参与这一过程。本研究揭示了AAMP对血管新生和VSMCs迁移的调控作用及分子机制，将为进一步研究AAMP在动脉粥样硬化疾病中的作用及机制提供理论基础。

目录

主要缩写词

1 绪 论

1.1 AAMP的研究进展

1.2 血管新生研究现状

1.3 核受体PPARγ与内皮功能和血管新生

1.4 问题的提出

1.5 整体研究思路及创新点

2 AAMP的生物信息学分析和在血管新生中的作用

2.1 引言

2.2 实验材料与实验方法

2.3 实验结果

2.4 讨 论

2.5 本章小结

3 AAMP通过调控内皮细胞迁移调控血管新生

3.1 引言

3.2 材料与方法

3.3 实验结果

3.4 讨 论

3.5 本章小结

4 罗格列酮激活的PPARγ信号参与调控AAMP介导的血管新生

4.1 引言

4.2 实验材料与实验方法

4.3 实验结果

4.4 讨 论

5 AAMP参与ox-LDL诱导的VSMCs迁移

5.1 引言

5.2 实验材料与实验方法

5.3 实验结果

5.4 讨 论

5.5 本章小结

6 结论与展望

6.1 主要结论

6.2 后续研究工作的建议

致谢

参考文献

附录

A.作者在攻读博士学位期间的科研论文:

B. 作者在攻读博士学位期间参与的科研项目