一种新型含铜不锈钢的生物学性能研究

摘要

众所周知，不锈钢材料具有较低的成本、理想的生物相容性、综合力学性能、机械加工性能以及耐腐蚀性能，目前已经被广泛应用于生物医用领域，如口腔、骨科、外科手术器械和生物医疗设备等。然而，传统的医用不锈钢材料仅仅发挥了其机械支撑属性，无法避免植入生物体内后导致微生物感染而出现炎症反应的问题。此外，该类感染的出现将持续反复，难以彻底杜绝。因此，为了解决植入物术后感染问题，在不牺牲其力学性能、机械加工性能以及耐腐蚀性能的先决条件下，赋予新型的317L不锈钢以优秀、广谱和耐久的抗菌属性，与此同时兼顾良好的生物相容性，是本论文研究的主旨所在。因此依据该研究理念，本研究在317L不锈钢基体内掺杂一定比例的具有抗菌作用的铜元素，并进一步借助特殊的热处理工艺对该含铜不锈钢进行加工，从而设计和开发出一类新型的317L-Cu不锈钢抗菌材料。
　　在本研究工作中，设计并制备了一种新型的317L-Cu不锈钢。首先通过系统的材料表征来观察其材料和表面性能的变化情况；随后，结合多种方法评价其抗菌性能；此外，联合利用多种生物学手段对其生物相容性进行系统地评价；最后，阐述317L-Cu不锈钢的抗菌作用机理，评估其在临床医学和日常生活等领域的潜在应用前景。
　　具体而言，主要的研究内容和结论如下：
　　①根据课题组前期研究结果，综合考虑商用成本因素，设计并制备出一种铜元素含量为4.5wt.％的新型的317L-Cu不锈钢，并借助扫描电镜、表面元素能谱分析、硬度检测、接触角及表面能计算、金相显微组织观察和耐腐蚀性能测试等实验对材料进行表征。测试结果表明：在铜元素添加前后，317L-Cu不锈钢材料的力学及表面元素参数变化不大，保持了较好的力学及表面特性，为材料的生物学研究及应用提供了可靠的基础。
　　②目前广泛采用的JIS Z2801:2000标准无法检测到细菌VBNC状态，而此状态下的细菌在复苏后仍然会对机体造成威胁。本研究针对该标准的不足，创新地对材料抗菌性能的评价进行了扩展，借助平板覆膜法、活死染色法和qPCR法分别在细胞活力、细胞膜和基因水平表征了317L-Cu不锈钢的抗菌性能。实验结果显示：317L-Cu不锈钢在细菌共培养1天的抑菌性能高达98.3%，并在共培养3天时长内持续展现出良好的杀菌性能。在S. aureus与317L-Cu不锈钢共培养3天后，扫描电镜观测到不锈钢表面的细菌生物膜出现了质膜内陷，内含物外泄等现象，展现了317L-Cu不锈钢优异的抗菌效用。与此同时，为今后医用材料尤其是植入物材料的抗菌性能评价提供了丰富的科学数据和进一步的优化建议。
　　③为了探究317L-Cu不锈钢材料溶出的Cu2+的潜在生物学毒性，本研究借助血液相容性、细胞相容性以及斑马鱼模型综合评价了317L-Cu不锈钢在体外和体内的毒性。其中MTT标记法和RTCA实时无标记细胞分析技术的结果相符合，均表明：两种不锈钢对 MC3T3-E1细胞的增殖没有显著的毒副作用，甚至317L-Cu不锈钢还在一定程度上表现出了促进 MC3T3-E1细胞增殖的现象。急性溶血实验和血小板粘附观察结果显示：两种不锈钢几乎都不存在溶血性（0.61±0.07%和0.72±0.13%）。与此同时，斑马鱼模型已经在药物筛选领域取得瞩目的成果，我们首次将其作为整体动物模型应用到317L-Cu不锈钢体内毒性的全面评价中，结果显示两种不锈钢对斑马鱼胚胎和幼鱼的发育前期不具有显著的毒副作用。
　　④通过对细菌在两种不锈钢材料表面形成生物膜内胞外聚合物（EPS）的傅立叶红外光谱（FTIR）分析及细胞膜表面铜离子情况的X射线光电子能谱学（XPS）检测探索了317L-Cu不锈钢对S.aureus生物膜的影响。此外，进一步通过活死（Live/Dead）荧光染色法及透射电子显微镜（TEM）表征317L-Cu不锈钢溶出的铜离子对于细菌细胞膜及内含物的损伤过程，并探究其抗菌机制：Cu2+对细菌的细胞膜和胞外分泌物均造成了损伤，致使细菌内含物泄露，生物膜形成受到抑制；317L-Cu不锈钢并未能对细菌的基因组DNA完整性造成显著影响，即317L-Cu不锈钢的抗菌性能并非通过破坏细菌基因组的完整性而体现。于此同时，我们推测了317L-Cu不锈钢同时具有良好杀菌能力及低细胞毒副作用的初步解释原因：细菌和细胞的膜结构、组成成分以及代谢活动存在差异造成其对外界相同刺激的反应也不一致，耐受能力也存在差异。低浓度的Cu2+本身是有助于细胞增殖，而在该浓度区间内，对细菌而言则是致命的。
　　综上所述，317L-Cu不锈钢具有理想的耐腐蚀性和生物安全性，并且在不显著降低317L不锈钢的优秀材料属性的前提下，兼具有良好的抗菌性能。因此，本论文研究的317L-Cu不锈钢是一种极具潜力可用于日常生活及临床医学上代替原有不锈钢材料的新型生物功能化不锈钢改进材料。

目录

主要缩写词表

1 绪 论

1.1 引言

1.2 抗菌不锈钢

1.3 其他抗菌材料

1.4 潜在的抗菌机制

1.5 抗菌材料抗菌性能的评价方法

1.6 本论文的研究意义与主要内容

1.7 创新性

2 317L-Cu不锈钢的元素组成、表面性能及耐蚀性能评价

2.1 引言

2.2 实验材料

2.3 实验方法

2.4 实验结果与讨论

2.5 本章小结

3 317L-Cu不锈钢的抗菌性能评价

3.1 引言

3.2 实验材料

3.3 实验方法

3.4 实验结果与讨论

3.5 本章小结

4 317L-Cu不锈钢的生物学评价

4.1 引言

4.2 实验材料

4.3 实验方法

4.4 实验结果与讨论

4.5 本章小结

5 317L-Cu不锈钢的抗菌机理研究

5.1 引言

5.2 实验材料

5.3 实验方法

5.4 实验结果与讨论

5.5 本章小结

6 结论与展望

6.1 主要结论

6.2 后续工作展望

致谢

参考文献

附录

B. 博士期间参与的课题