HSP90抑制剂17AAG对HTLV-1感染HUT细胞株JAK3/STAT5信号通路的影响

摘要

背景：
　　成人T细胞白血病（adult T-cell leukemia，ATL）是一种与人T细胞白血病病毒Ⅰ（HTLV-Ⅰ）感染直接相关、发生于成人的特殊类型淋巴系统恶性克隆增殖性疾病，急性期ATL侵袭性极强。ATL的预后不良因素与HTLV-1感染的细胞具有异常强大的无限增殖以及抑制凋亡能力有关，亦与其对传统化疗药物的先天耐药性有关，因此目前迫切需要新的治疗方法改善ATL的不良预后。
　　JAK-STAT信号通路是近年来发现的一条由细胞因子刺激的信号转导通路，参与细胞的增殖、分化、凋亡以及免疫调节等许多重要的生物学过程。它主要由三个成分组成，即酪氨酸激酶相关受体、酪氨酸激酶JAK和转录因子STAT。很多研究成果都表明，JAK-STAT通路的异常激活在ATL的病理机制中占据着重要的地位。在ATL细胞中普遍存在着JAK-STAT信号通路的持续激活。
　　热休克蛋白90（HSP90）在 ATL细胞内的异常高水平表达被认为与 ATL的发病有关。近年来研究表明，ATL细胞内多条信号转导通路相关蛋白均为HSP90的客体蛋白，并通过HSP90的作用被异常激活。正常细胞hsp90低水平表达，不与其他辅助分子伴侣形成复合物，处于非活化状态。但是，在恶性肿瘤细胞中，hsp90异常高水平表达，形成”客体蛋白-hsp90-辅助分子伴侣”的所谓超级分子伴侣复合物结构(辅助分子伴侣包括 hsp70,CDC37)，稳定突变或异常活化的癌基因相关蛋白，使之免受泛素-蛋白酶体通路的降解作用，促进肿瘤细胞的异常增殖。
　　本研究将以上所述作为理论基础，选用HTLV(+)ATL细胞株HUT-102作为研究对象，采用WESTERN-BLOT、免疫共沉淀、流式细胞术等多种现代生物学检测方法，探讨ATL细胞内HSP90与JAK/STAT通路异常持续性激活之间是否存在一定的联系，是怎样的联系，以此希望进一步加深对ATL发病机制的理解，为ATL的靶向治疗研究提供更多的理论依据。
　　研究内容与方法：
　　1、细胞培养，使用RP-1640+10％胎牛血清配成完全培养基培养HUT-102细胞，并定期传代、换液。
　　2、WESTERN-BLOT方法：
　　2.1.检测HUT-102细胞、JURKAT细胞以及外周血单个核细胞（PBMC）内JAK3蛋白、STAT5蛋白、P-STAT5蛋白、HSP90表达。观察各组细胞间蛋白表达量的不同。
　　2.2.稀释不同浓度 HSP90特异性抑制剂17-AAG(0-2000NM)作用于HUT-102细胞24、48小时，分别提取各组细胞总蛋白，WESTERN-BLOT检测各组JAK3蛋白、STAT5蛋白以及P-STAT5蛋白表达的变化趋势。
　　2.3.使用1000NM浓度17AAG作用于HUT-102细胞0、3、6、9、12、24小时后提取细胞总蛋白，WESTERN-BLOT检测各组JAK3蛋白、STAT5蛋白以及P-STAT5蛋白表达的变化趋势。
　　2.4.分别设入无刺激组、17AAG+CP690550组、17-AAG组、CP690550组分别刺激 HUT-102细胞24h，提取处理细胞总蛋白 WESTERN-BLOT检测JAK3蛋白表达情况
　　3、RT-PCR
　　将不同浓度（0、125、250、500、1000NM）抑制剂刺激 HUT-102细胞24h后，提取细胞总RNA，使用RT-PCR方法检测各组细胞JAK3mRNA的表达情况，GAPDH为设定内参。
　　4、CCK8
　　稀释不同浓度17AAG(0、500、1000、2000、4000、5000、8000NM)作用于HUT-102细胞，分别于12、24、48、72小时后CCK8法检测细胞吸光度值，计算细胞存活率。
　　5、AnnexinV-PI
　　稀释17AAG浓度至0、250、500、1000、2000NM分别作用于HUT-102细胞，48小时后AnnexinV-PI法结合流式细胞仪检测分析细胞凋亡率。
　　6、免疫共沉淀（CO-IP）
　　将JAK3抗体、磁珠与HUT-102细胞总蛋白内JAK3蛋白相结合，将磁珠-蛋白-抗体复合物沉淀后去除磁珠跟抗体，WESTERN-BLOT检测沉淀蛋白内是否含有HSP90蛋白。
　　结果
　　1、HSP90蛋白在正常人PBMC以及细胞株HUT-102、JURKAT中均有表达。但正常人HSP90蛋白表达量显著低于两种T淋巴肿瘤细胞株，JAK3/STAT5蛋白几乎不表达。与JURKAT细胞相比，HUT-102细胞内HSP90、JAK3、STAT5以及P-STAT5蛋白表达量显著增高。
　　2、CCK8结果显示,随着17AAG浓度的增加以及孵育时间的增长，细胞存活率逐渐下降。其中17AAG浓度在0-2000NM之间时下降最明显，在浓度达到2000NM以后细胞存活率达到最低值并趋于平稳。从时间上分析结果显示，随着孵育时间的延长，17AAG对细胞的抑制作用逐渐加大，至48h时细胞抑制率达到最大，而后到72h时，与48h相比结果无明显差异（P>0.05）
　　3、使用流式细胞仪分析细胞凋亡。Annexin V-FITC（+）PI（-）为早期凋亡细胞，Annexin V-FITC(+)PI(+)为晚期凋亡细胞。结果显示使用17-AAG后肿瘤细胞 HUT-102的早期凋亡细胞所占比例增加。着17-AAG浓度的上升，HUT-102细胞凋亡率逐渐增加。
　　4、与未刺激组相比，刺激组JAK3与P-STAT5蛋白表达明显下降（P<0.05）。随着抑制剂浓度的增加，这种抑制强度随之增加。各浓度（125-2000NM）抑制剂作用细胞48h时，P-STAT5蛋白几乎检测不出。同样条件下，检测总STAT5蛋白发现，各刺激组与非刺激组总STAT5蛋白表达之间无显著差异（P>0.05）。
　　5、同一浓度水平下，随着抑制剂作用时间增长，JAK3蛋白表达水平逐渐降低，至24h时几乎检测不出。而P-STAT5蛋白水平在1000NM浓度的17-AAG作用≥4h后均检测不出。但HUT-102细胞总STAT5蛋白表达水平并未随抑制剂作用时间的变化而有所增减（P＞0.05）。
　　6、使用RT-PCR方法检测不同浓刺激下细胞JAK3mRNA表达情况。各刺激组细胞 JAK3mRNA并未随着抑制剂17-AAG浓度的增加而明显变化，（P>0.05）。
　　7、根据 CO-IP结果显示，使用JAK3抗体沉淀天然构象蛋白，WESTERN-BLOT除可检测到JAK3蛋白沉淀外，同时也检测出小部分HSP90蛋白的沉淀。
　　8、使用CP690550与17-AAG共同刺激细胞，结果显示单独组中17-AAG对JAK3蛋白抑制作用强于CP690550。而与17-AAG/CP690550单独刺激组相比，两种抑制剂共同刺激组对细胞JAK3蛋白过表达的抑制作用更强。
　　结论
　　1 JURKAT、HUT-102细胞内HSP90蛋白表达量较正常外周血单个核细胞明显升高。HUT-102细胞内JAK3/STAT5通路异常持续活化。
　　2、证明JAK3为HSP90客体蛋白。
　　3、17-AAG可抑制JAK3/STAT5信号通路持续活化，呈时间、剂量依赖作用。
　　4、17-AAG可抑制HUT-102细胞增殖，并诱导细胞凋亡。
　　5、JAK3抑制剂CP690550与17AAG在HUT-102细胞内可能存在协同作用。

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中英文对照词汇表

中文摘要

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前言

实验材料

1.1 细胞来源

1.2 实验仪器

1.3实验试剂及耗材

1.4实验溶剂制备:

2 实验方法

2.1细胞培养

2.2 Wstern-Blot检测胞内蛋白表达

2.3 RT-PCR

2.4 免疫共沉淀（CO-IP）

2.5 CCK8检测17-AAG细胞增殖抑制作用

2.6 Annexin V-PI试剂盒检测细胞凋亡

2.7统计学方法

3 结果

3.1 HSP90、JAK3、STAT5蛋白在正常人及HUT102、Jurkat细胞中表达情况

3.2 HSP90蛋白抑制剂17AAG对HUT-102细胞的生物学影响

3.3 HSP90与JAK3之间相互作用关系

3.4 JAK3抑制剂CP690550与HSP90抑制剂联合作用对JAK3/STAT5通路的影响

4.0 讨论

全文结论

参考文献

针对热休克蛋白90的靶向治疗在恶性血液病中的研究进展

研究生期间发表论文情况

致谢

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