蝗绿僵菌Macwh基因功能研究

摘要

真菌细胞壁涉及细胞附着，形态建成等多种生理功能。细胞壁在病原性真菌的抗逆及侵染致病过程中发挥着非常重要的作用。荧光增白剂高度敏感蛋白cwh具有维持细胞壁完整性的功能，这一现象仅在酿酒酵母中有报道，在致病真菌中尚无该类基因的研究和报道。昆虫病原真菌具有独特的体壁侵染方式，细胞壁在病原性真菌的抗逆及侵染致病过程中发挥着十分重要的作用。本研究以蝗绿僵菌（Metarhizium acridum）为实验材料，通过同源重组的方法构建该基因的敲除及回复菌株对该基因进行功能研究。获得了以下实验结果：
　　1.Macwh1和Macwh2生物信息学分析
　　根据蝗绿僵菌基因组序列设计引物，克隆得到Macwh1和Macwh2基因，生物信息学分析表明Macwh1与Macwh2编码的氨基酸序列无同源性。其中Macwh1登录号为XP_007815818，编码957个氨基酸，等电点为7.02，蛋白质分子量为107.02KDa，基因组含7个内含子。Macwh2登录号为XP_007808921，编码的氨基酸133个，等电点为9.48，蛋白质分子量为13.85KDa，基因组含2个内含子。
　　2.Macwh单敲除及回复菌株、Macwh1-Macwh2双敲除菌株的获得
　　为了研究蝗绿僵菌Macwh1和Macwh2的功能，利用同源重组的方法构建了各基因的敲除载体，并在此基础上构建了回复载体。利用农杆菌介导转化蝗绿僵菌，经抗性筛选PCR验证筛选及Southen杂交验证，得到正确的敲除菌株和回复菌株。
　　3.Macwh的缺失导致蝗绿僵菌毒力降低
　　以东亚飞蝗五龄虫为实验材料，对其进行体表点滴和体内注射接种实验。实验结果表明：体表点滴实验中敲除菌株的毒力都显著低于野生型回复菌株，并且蝗虫血液中虫菌体数量显著减少；而注射实验表明，各敲除菌株与野生型和回复菌株相比，毒力并无显著差异。对毒力机制研究的结果表明Macwh的缺失不影响蝗绿僵菌孢子在蝗虫后翅上萌发，而影响附着胞的形成率及其膨压。Macwh通过调控与体壁穿透相关基因的表达量进而影响毒力。
　　5.Macwh影响细胞壁的完整性及抗逆性
　　对细胞壁组分和结构分析发现，各敲除菌株中几丁质、甘露糖蛋白含量的显著低于野生型，而β-1,3-葡聚糖含量与野生型相比无显著差异；透射电镜表明，各敲除菌株细胞壁变薄。RT-PCR检测表明，与孢子细胞壁完整性相关基因中几丁质合成酶基因的表达显著下调，孢子疏水性测定实验表明，各敲除菌株孢子的疏水性降低，孢子表面疏水蛋白基因的表达量也显著下调。在加入了细胞壁破坏剂（CFW）的1/4SDA培养基上，敲除菌株的菌落显著小于野生型，表明对细胞壁破坏剂敏感；紫外照射处理后，敲除菌株与野生型相比孢子萌发率显著降低，通过qRT-PCR对紫外相关基因如phr1，uve-1等基因的转录水平进行检测发现，各敲除菌株中phr1，uve-1的表达量均显著下调。结果表明Macwh影响了细胞壁的完整性，Macwh通过影响与抗紫外相关基因的表达量，进而影响对紫外的耐受性。
　　综上所述，Macwh在蝗绿僵菌侵染致病过程的侵染阶段及细胞壁完整性发面具有十分重要的作用。

目录

缩 略 词

1 绪 论

1.1 引言

1.2 研究背景

1.2.1 昆虫病原真菌致病机制的研究进展

1.2.2 荧光增白剂高度敏感蛋白cwh（Calcofluor white hypersensitive protein ）功能的研究进展

1.3 研究目的

1.4 技术路线

1.5 本研究的创新之处

2 绿僵菌Macwh的克隆与基因功能研究

2.1 实验材料

2.1.1 供试菌株及昆虫

2.1.2主要试剂

2.1.3主要培养基

2.1.4 主要实验溶液

2.1.5 主要设备

2.1.6主要应用软件

2.2.1 Macwh基因的生物信息学分析

2.2.2 Macwh敲除突变载体和回复突变载体的构建

2.2.3农杆菌AGL-1感受态细胞的制备

2.2.4电转化农杆菌

2.2.5农杆菌介导的蝗绿僵菌的转化

2.2.6敲除菌株和回复菌株的筛选及验证

2.2.7蝗绿僵菌基因组的微量提取

2.2.8蝗绿僵菌基因组的大量提取

2.2.9 RNA的提取及反转录

2.2.10 qRT-PCR

2.2.11蝗绿僵菌的毒力分析

2.2.12 Macwh对蝗绿僵菌孢子特性的影响

2.2.13 Macwh对蝗绿僵菌孢子细胞壁组分和结构的影响

2.3.1 Macwh生物信息学分析

2.3.2 Macwh单敲除及回复菌株，Macwh1-Macwh2双敲除菌株的构建

2.3.3 Macwh对生长和产孢的影响

2.3.4 Macwh对逆境敏感性的影响

2.3.5 Macwh对细胞壁组分和结构的影响

2.3.6 Macwh对蝗绿僵菌毒力的影响

2.3.7 Macwh在穿透昆虫体壁中的作用

2.4 讨论

3 主要结论与后续工作建议

3.1 主要结论

3.2 后续工作

致谢

参考文献

附录

A. 序列

B. 作者在攻读硕士学位期间发表的论文目录