CKLF1-C19多肽对博莱霉素诱导小鼠肺纤维化病变的干预作用

摘要

研究背景：
　　Chemokine-like factor1（CKLF1）是北京大学人类疾病基因研究中心首次在国际上克隆的一个新细胞因子，获国内和国际专利1。CKLF1含有CC家族趋化因子的特征性结构，有研究表明CKLF1对白细胞趋化作用，可促进小鼠骨骼肌的增殖，并可促进人低密度骨髓增殖及集落形成等1。研究证实 CKLF1的功能性受体是CCR42。紧随 CKLF1的源头创新工作，本课题组曾首次在国际上报道了CKLF1在哮喘患者的外周血单个核细胞及气道粘膜中高表达3；首次报道了CKLF1可在小鼠体内诱导支气管肺的炎性损伤及重塑作用4,5。因此干预CKLF1介导的炎症趋化作用，寻找新的相关治疗靶点无疑具有重要的临床意义。
　　进一步的研究表明重组CKLF1在果蝇 S2细胞中可分泌一个位于C末端的19个氨基酸肽段，被命名为CKLF1-C19多肽，简称C196。实验表明C19可抑制由CKLF1导致的趋化作用，在小鼠支气管哮喘、过敏性鼻炎等疾病中发挥着干预治疗作用，可能是CKLF1的有效拮抗剂7,8。因此，我们推测C19亦可在肺纤维化病变中发挥干预炎症的作用。为此我们将 C19合成肽引入到肺纤维化研究中。研究分为三个部分：第一部分探讨无创肺功能监测在博莱霉素诱导的小鼠肺纤维化模型中的应用价值；第二部分探讨 C19在博莱霉素诱导的小鼠肺纤维化模型中的干预保护作用；第三部分探讨 C19在不同给药阶段对于博莱霉素诱导的小鼠肺纤维化模型中的治疗作用。
　　第一部分：探讨无创肺功能监测在博莱霉素诱导的小鼠肺纤维化模型中的应用价值目的：
　　制备肺纤维化模型，探讨无创肺功能监测在博莱霉素诱导的小鼠肺纤维化模型中的应用价值。
　　方法：
　　20只C57 BL/6雌性小鼠随机分为NS组和模型组，模型组小鼠气管滴入0.1ml博莱霉素溶液（5mg/kg），而NS组小鼠则给0.1ml生理盐水。在造模前、造模7、14、21天分别监测每一只小鼠的无创肺功能指标Penh值(增强呼吸间隙)及各自体重，并在造模21天后留取小鼠的肺组织做常规H&E染色。
　　结果：
　　造模前小鼠体重及Penh值两组均无显著差异（P>0.05）。模型组小鼠体重在造模7、14、21天显著低于NS组（P<0.05）；而模型组Penh值在造模7、14、21天却显著高于NS组（P<0.05）。在肺组织HE染色中可见模型组小鼠肺组织结构破坏、炎症细胞浸润及局部纤维增生，且小鼠肺纤维化程度（Ashcroft评分）与Penh值呈高度正相关（r=0.869，P＜0.001）。
　　结论：
　　Penh值与博莱霉素诱导小鼠肺纤维化模型中的胶原纤维沉积和肺组织病理改变成高度正相关，可有效反映肺纤维化病理改变，并作为气流受阻及肺阻力的动态指标。
　　第二部分：探讨C19在博莱霉素诱导的小鼠肺纤维化模型中的干预保护作用目的：
　　探讨C19在博莱霉素诱导的小鼠肺纤维化模型中的干预保护作用。
　　方法：
　　50只C57 BL/6雌性小鼠随机分为NS组、模型组及药物低中高剂量组。模型组和药物低中高剂量组小鼠气管滴入0.1ml博莱霉素溶液（5mg/kg），而NS组小鼠则给0.1ml生理盐水。在造模当天即给予药物组小鼠腹腔注射 C19溶液，并从造模当天直至造模第21天，C19按药物低中高剂量组的不同分别给予每只小鼠每天1ug、10ug、100ug；而模型组和NS组小鼠则给予同等体积的生理盐水腹腔注射。记录小鼠每天生存状态及体重，在造模第21天留取小鼠肺泡灌洗液（BALF），并留取左肺的肺组织行H&E染色，观察其病理形态改变；留取小鼠右肺的肺组织行羟脯氨酸（HYP）含量测定。
　　结果：
　　在小鼠一般生存状态观察、体重分析中药物低中高剂量组优于模型组；在肺泡灌洗液中的细胞计数、肺组织羟脯氨酸含量统计中，药物低中高剂量组小鼠均显著低于模型组小鼠；在病理学形态观察中，药物低中剂量组与模型组相比较，可显著减轻炎症细胞的浸润及间质纤维细胞的增生，较好的恢复了小鼠正常的肺组织结构。
　　结论：
　　C19可降低博莱霉素诱导的肺纤维化小鼠的死亡率、减轻肺部炎症细胞的浸润和间质纤维细胞的增生、及显著降低肺组织羟脯氨酸的含量。其中 C19低剂量组与其他药物组相比，更能显著减轻肺部炎症细胞的浸润和间质纤维细胞的增生第三部分：探讨C19在不同给药阶段对博莱霉素诱导的小鼠肺纤维化模型的治疗作用。
　　目的：
　　探讨 C19在不同给药阶段对于博莱霉素诱导的小鼠肺纤维化模型中的治疗作用。
　　方法：
　　80只C57 BL/6雌性小鼠随机分为8组：○1 NS组，每天每只小鼠给予腹腔注射0.2ml生理盐水；○2模型组，每天每只小鼠给予腹腔注射0.2ml生理盐水；○3 C19-1ug1-21天组（每只小鼠每天腹腔注射1ug的C19溶液，从造模当天至造模第21天）；○4 C19-1ug1-10天组（每只小鼠每天腹腔注射1ug的C19溶液，从造模当天至造模第10天）；○5 C19-1ug7-21天组（每只小鼠每天腹腔注射1ug的C19溶液，从造模第7天至造模第21天）；○6 C19-5ug1-21天组（每只小鼠每天腹腔注射5ug的C19溶液，从造模当天至造模第21天）；○7 C19-5ug1-10天组（每只小鼠每天腹腔注射5ug的C19溶液，从造模当天至造模第10天）；○8 C19-5ug7-21天组（每只小鼠每天腹腔注射5ug的C19溶液，从造模第7天至造模第21天）。记录小鼠每天生存状态，并在实验前，造模第3、7、11、14、17、21天分别测各组小鼠的无创肺功能指标。在造模第21天深度麻醉所有小鼠后，监测小鼠有创肺功能指标，再行腹主动脉放血，用4℃PBS进行肺泡灌洗（每次0.8ml,抽吸3次，总共灌洗3次），留取肺泡灌洗液行细胞计数。并留取小鼠左肺的肺组织行H&E染色，观察其病理形态改变；留取小鼠右肺的肺组织行羟脯氨酸含量测定。
　　结果：
　　通过对小鼠生存率、体重、Penh值、气道内阻力、BALF中的细胞计数、肺组织HYP含量及病理切片H&E染色的方面分析，C19的1ug三个不同组别对于肺纤维化均有明显的治疗作用。而C19的5ug组在造模当天开始给药的1-21天组和1-10天组在生存率、体重、肺功能、BALF细胞计数、HYP含量、病理等方面有不同程度上可对肺纤维化有保护干预作用，但从造模第7天开始给药的组别小鼠死亡率显著高于模型组小鼠，且在HYP含量、病理方面也接近于模型组的结果，其缓解肺纤维化的效果不十分显著。
　　结论：
　　C19（1ug）可降低博莱霉素诱导的肺纤维化小鼠的死亡率、减缓造模所致体重下降的趋势、缓解造模所致的Penh值和气道内阻力升高的趋势、降低肺组织羟脯氨酸的含量，及显著减轻肺部炎症细胞的浸润和间质纤维细胞的增生。除C19-5ug的7-21天组之外，C19（5ug）的其他组别同样具有上述缓解博莱霉素所致肺纤维化病变进展的作用。

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封面

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英文摘要

前 言

1材料

2 方法

3 结果

讨 论

结 论

第二部分 探讨C19在博莱霉素诱导的小鼠肺纤维化模型中的干预保护作用

1材料

2 方法

3 结果

讨 论

结 论

第三部分 探讨C19在不同给药阶段对于博莱霉素诱导的小鼠肺纤维化模型中的治疗作用。

1材料

2 方法

3 结果

讨 论

结 论

参考文献

综述

17. 已发表的论文摘要

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