舟山眼镜蛇细胞毒素1诱导HL-60和KG1a细胞死亡及其机制研究

摘要

背景与目的:
　　人急性髓系白血病（Acute myeloid leukemia,AML）是严重威胁人类健康和生命的最常见的疾病之一，其死亡率高，临床多采用化疗。传统的化疗在杀伤白血病细胞的同时，往往对正常造血组织、免疫细胞等也有较大的破坏作用，从而引起严重感染、出血等并发症，甚至可导致病人死亡。由于目前许多化疗药物的临床治疗效果并不理想且毒副作用大，严重影响患者的生活质量，寻求高效低毒的抗肿瘤药物及治疗方法一直是研究的热点。近年来，在肿瘤研究领域通过体外实验及动物实验发现，一些生物毒素如蛇毒中的细胞毒素能抑制肿瘤细胞增殖，为临床抗肿瘤治疗提供了新的思路。
　　蛇毒细胞毒素又称为心脏毒素或膜毒素，本课题组从舟山眼镜蛇毒中分离纯化出细胞毒素1（Cytotoxin1，CTX1），该碱性小分子多肽是由60个氨基酸残基组成，分子质量为6698 Da。本课题组的前期研究证实了CTX1对多种肿瘤细胞有选择性杀伤作用，但其机制还有待于进一步研究。目前有关CTX1的研究除本课题组报道外未见报道，且有关CTX1抗急性白血病作用及机制未见文献报道。
　　本实验采用2种急性白血病细胞株：人急性粒-单核白血病细胞HL-60和人急性髓系白血病细胞KG1a为实验对象，研究CTX1的抗急性白血病作用及其相关作用机制。
　　研究内容包括：
　　1、CTX1对白血病细胞和正常细胞的选择性杀伤作用；
　　2、CTX1对HL-60和KG1a细胞死亡的影响；
　　3、蛋白合成抑制剂放线菌酮（Cycloheximide，CHX）对CTX1诱导HL-60和KG1a细胞死亡的影响；
　　4、三种抑制剂（Caspase家族广谱抑制剂Z-VAD.fmk、溶酶体组织蛋白酶Cathepsin B抑制剂CA-074 Me、RIP1激酶特异性抑制剂Nec-1）对CTX1诱导HL-60和KG1a细胞死亡的影响；
　　5、CTX1对溶酶体膜通透性（LMP）和线粒体膜通透性（MMP）的影响；
　　实验方法:
　　1 MTS法
　　检测CTX1对HL-60细胞相对活力的影响。
　　2 CASY?-Tecnology细胞计数法
　　CTX1作用于KG1a细胞后，进行细胞计数并计算细胞相对活力。
　　3乳酸脱氢酶（LDH）活力测定
　　4荧光显微术原位观察活细胞培养体系细胞死亡情况（PI染色）
　　4.1观察CTX1作用于HL-60和KG1a细胞死亡情况
　　4.2观察Nec-1对CTX1诱导HL-60和KG1a细胞死亡情况的影响
　　5流式细胞术检测Annexin V-FITC、PI双染后细胞死亡情况
　　5.1验证CTX1对HL-60和KG1a细胞的影响
　　5.2检测 CTX1对正常小鼠骨髓单个核细胞（Bone Marrow mononuclear Cell，BMNC）的影响
　　5.3检测CHX对CTX1诱导HL-60和KG1a细胞死亡的影响
　　5.4检测Z-VAD.fmk、CA-074 Me和Nec-1对CTX1诱导HL-60和KG1a细胞死亡的影响
　　5.5线粒体膜电位检测：Rhodamine123染色后检测HL-60和KG1a细胞的荧光强度。
　　6溶酶体特异性荧光标记
　　LysoTracker Green DND-26染色后于激光共聚焦显微镜下观察采集照相。
　　结果：
　　1 CTX1对白血病细胞和正常细胞相对活力的影响
　　MTS法和CASY?-Tecnology法检测CTX1对两种白血病细胞HL-60和KG1a均具有抑制作用，半数抑制浓度（IC50）分别为10.182μg/ml和3.311μg/ml，并呈现剂量依赖和时间依赖关系(P<0.05)。与白血病细胞株相比，CTX1对BMNC基本无杀伤作用，以 CTX1浓度为4μg/ml为例，细胞相对活力为（92.93±0.47）％，与对照组（92.03±0.93）%相比无统计学意义（P>0.05，n=3）。说明CTX1对急性白血病细胞株有选择性杀伤作用，且CTX1对HL-60和KG1a的IC50不同，说明CTX1对不同白血病细胞株的抑制作用也具有选择性。
　　2 CTX1对HL-60和KG1a细胞死亡的影响
　　2.1流式细胞术检测结果显示，CTX1诱导HL-60和KG1a死亡，且呈现剂量依赖和时间依赖关系；CTX1主要引起细胞发生晚期凋亡和坏死，而早期凋亡均不明显。以CTX1作用于KG1a细胞48h为例，早期凋亡率为(0.40±0.10)%，而晚期凋亡和坏死为(63.87±3.73)%。
　　2.2荧光显微术原位观察细胞死亡情况：对照组的绝大部分HL-60和KG1a细胞形态正常、胞膜光滑完整，未被PI染色。随着CTX1浓度的增加，PI红染的细胞数（即死亡细胞数）明显增多。
　　2.3随着CTX1浓度增加，KG1a细胞培养体系中LDH活力逐渐增加。
　　3 CHX对CTX1诱导HL-60和KG1a细胞死亡的影响
　　流式结果显示CTX1浓度为8μg/ml、12μg/ml和3μg/ml和4μg/ml分别作用于HL-60和KG1a细胞，作用时间分别为12h和36h时的细胞存活率分别为（64.43±9.46）、（40.37±11.63）和（64.90±3.57）、（57.97±2.14），CTX1主要引起HL-60和KG1a细胞发生晚期凋亡和坏死；经CHX作用后的细胞存活率分别为（84.80±0.50）、（81.57±9.53）和（80.83±3.84）、（76.23±3.98），CHX阻断组与CTX1单独组相比有显著性差异（P<0.01）。CHX能够明显逆转CTX1诱导的HL-60和KG1a细胞死亡，说明CTX1引起HL-60和KG1a细胞的死亡是一种诱导性死亡。
　　4三种抑制剂Z-VAD.fmk、CA-074 Me和Nec-1对CTX1诱导HL-60和KG1a细胞死亡的影响
　　4.1应用Z-VAD.fmk或CA-074 Me预处理细胞1小时，再用CTX1（8μg/ml、12μg/ml）处理HL-60细胞12 h，用CTX1（3μg/ml、4μg/ml）处理KG1a细胞24 h，流式细胞术检测Annexin V-FITC、PI双染后HL-60和KG1a细胞死亡情况，结果显示：Z-VAD.fmk可减轻CTX1作用后的HL-60和KG1a细胞的死亡，以KG1a细胞为例，应用Z-VAD.fmk后，细胞死亡数由（39.20±1.71）%降至（34.23±3.98）%，且具有统计学意义（p<0.05）。应用CA-074 Me可明显减轻CTX1作用后HL-60细胞的死亡，而对KG1a细胞的逆转作用不明显。
　　4.2用Nec-1预处理HL-60和KG1a细胞12h，再加入CTX1分别作用于HL-60细胞12h和KG1a细胞24h，流式结果显示CTX1（8μg/ml和12μg/ml）作用12h时的细胞存活率为（51.7±1.31）和（38.27±2.15），经Nec-1作用后的细胞存活率分别为（74.20±3.85）和（70.97±10.10），与CTX1单独组相比有显著性差异（P<0.01）。结果表明CTX1诱导的HL-60细胞死亡能够显著被Nec-1逆转，说明CTX1诱导HL-60细胞死亡的机制为一种Caspase非依赖的新的死亡方式，即Necroptosis。而Nec-1不能逆转CTX1诱导的KG1a细胞死亡，说明CTX1导致KG1a细胞的死亡不是通过Necroptosis途径进行的。
　　5 CTX1对HL-60和KG1a细胞LMP和MMP的影响
　　5.1 CTX1对LMP的影响：溶酶体特异性染色后，应用激光共聚焦显微镜可见，CTX1浓度为8μg/ml、12μg/ml作用于HL-60细胞12h和CTX1浓度为2μg/ml、4μg/ml作用于KG1a细胞48h后，HL-60和KG1a细胞荧光强度较阴性对照组均减弱，且二者都是随着CTX1浓度的增加，细胞荧光强度逐渐减弱，反映了溶酶体膜完整性丢失，CTX1诱导LMP增加。
　　5.2 CTX1对MMP的影响：HL-60和KG1a细胞经罗丹明123染色后用流式细胞仪检测。CTX1（4、8、12μg/ml）作用于HL-60细胞12h，低浓度处理组（4μg/ml）荧光强度较对照组无明显变化，CTX1高浓度组（12μg/ml）与对照组相比荧光强度减弱。而CTX1（2、3、4μg/ml）作用于KG1a细胞24h，处理组荧光强度较对照组明显减弱，且带有低荧光强度细胞所占百分率随着CTX1剂量的增加而增加。
　　结论：
　　1 CTX1对急性白血病细胞HL-60和KG1a细胞具有选择性杀伤作用，并且该作用呈现剂量依赖和时间依赖关系。
　　2 CTX1导致HL-60和KG1a细胞的死亡为诱导性死亡。
　　3 CTX1能够诱导HL-60细胞发生Necroptosis，可能的的机制包括RIP1的激活以及溶酶体膜的通透化；CTX1导致KG1a细胞死亡的机制可能与线粒体膜通透性增加和溶酶体通透化有关。

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封面

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中英文缩略词对照表

中文摘要

英文摘要

前言

材料与方法

1 实验材料

2 实验方法

结果

1 CTX1对白血病细胞和正常细胞相对活力的影响

2 CTX1对HL-60和KG1a细胞死亡的影响

3 CHX对CTX1诱导HL-60和KG1a细胞死亡的影响

4 三种抑制剂Z-VAD.fmk、CA-074 Me和Nec-1对CTX1诱导HL-60和KG1a细胞死亡的影响

5 CTX1对HL-60和KG1a细胞LMP和MMP的影响

讨论

结论

参考文献

综述

攻读学位期间的研究成果

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