悬浮力学状态对乳腺肿瘤细胞转移能力的调控及其力学生物学机制

摘要

肿瘤转移引起的器官衰竭是导致肿瘤患者死亡的主要原因。肿瘤转移是一个多步骤、多阶段和多基因参与的复杂过程。除了生化因素，肿瘤细胞本身的力学特性和力学微环境(如基质力学、流体剪切力等)也是影响肿瘤转移的重要方面。肿瘤细胞“失巢”后的悬浮力学状态是转移过程中真实存在的一种生物力学因素。已有研究表明悬浮力学状态可以通过调控细胞骨架结构和基因表达参与乳腺肿瘤细胞的再贴壁和抗凋亡过程。但是，目前关于悬浮力学状态对肿瘤转移影响的研究还不够全面，相关力学生物学机制也不甚清楚。因此，本研究拟从生物力学的角度出发，系统性地探索乳腺肿瘤细胞散播过程中悬浮状态对转移的影响并探索其可能的力学生物学机制，主要研究内容和结果如下：
　　①悬浮力学状态对乳腺肿瘤细胞再粘附的影响及其力学生物学机制
　　以贴壁培养为对照，利用不黏附基底悬浮培养乳腺肿瘤细胞MDA-MB-231和SK-BR-3。检测悬浮状态对乳腺肿瘤细胞粘附和再贴壁的影响，并探索其力学生物学机制。结果表明，悬浮状态改变肌动蛋白骨架的聚合和细胞收缩状态；快速且可逆地提高核纤层蛋白A/C(Lamin A/C)的蛋白水平，促进再贴壁乳腺肿瘤细胞的粘附和铺展及其应力纤维丝和粘着斑的形成，降低细胞的运动性，同时提高细胞核的圆度和细胞刚度。裸鼠恶性胸腔积液中悬浮肿瘤细胞体外再贴壁实验证明体内悬浮状态也能促进肿瘤细胞的再贴壁。悬浮状态引起的Lamin A/C上调与细胞骨架扰乱有关。同时，悬浮状态也通过上调整合素β1(Integrinβ1)的表达促进乳腺肿瘤细胞的粘附能力。
　　②悬浮力学状态对乳腺肿瘤细胞存活、迁移、侵袭和体内转移的影响
　　为了探究悬浮状态对乳腺肿瘤细胞转移能力的影响，首先在细胞水平上，检测悬浮状态下乳腺肿瘤细胞MDA-MB-231和SK-BR-3的增殖、凋亡、迁移和侵袭能力；检测乳腺肿瘤细胞再贴壁后的增殖和克隆能力，以及饥饿应激条件下细胞的生存能力。然后在动物水平上，考察悬浮状态对乳腺肿瘤细胞成瘤能力和转移能力的影响。细胞实验证明，悬浮状态下乳腺肿瘤细胞增殖活性低，并出现一定程度的凋亡，悬浮状态尽管会影响乳腺肿瘤细胞体外的克隆形成能力以及引起再贴壁后增殖滞后，但提高了乳腺肿瘤细胞在低营养应激条件下的存活，以及提高迁移和侵袭能力。动物实验证明，悬浮状态提高肿瘤细胞的休眠，抑制肿瘤的生长速度，但显著地促进了肺转移的形成。
　　③悬浮力学状态对乳腺肿瘤细胞基因表达的调控
　　为了考察悬浮状态下肿瘤细胞基因表达谱的改变并深入探讨悬浮促进肿瘤转移的机制，提取悬浮培养或正常贴壁培养的MDA-MB-231细胞的总RNA，利用Illumina HiSeq2000测序平台进行高通量转录组测序并进行信息学分析，再用定量PCR和免疫印迹技术对肿瘤转移相关基因进行表达验证。与贴壁培养细胞相比，悬浮状态上调254个基因，下调190个基因(|log2 Fold change|>2, FDR<0.05)；差异基因主要富集于免疫响应调节、细胞周期、细胞粘附、细胞外基质成分、细胞迁移、凋亡调节等生物过程。验证实验表明悬浮状态时间依赖性地上调促转移相关基因的表达，包括PTGS2、FN、LOX1、ABCC3、ICAM-1、MUC1、SELPLG、TGFBR2、TGFB1；再贴壁后这些基因表达逐渐降低并恢复至贴壁培养细胞水平。
　　④悬浮力学状态诱导环氧合酶-2(cyclooxygenase-2,COX-2)上调的力学生物学机制及其在乳腺肿瘤细胞转移过程的作用
　　为了考察悬浮力学状态诱导COX-2上调的力学生物学机制及其在乳腺肿瘤细胞转移过程的作用，首先探讨了钙离子(calcium ion,Ca2+)/钙调磷酸酶(calcineurin,CaN)/活化T细胞核因子(nuclear factor of activated T cells,NFAT)/COX-2信号通路在悬浮状态引起的肿瘤细胞特性改变中的作用；利用骨架抑制剂处理悬浮和贴壁肿瘤细胞以及不同刚度聚丙烯酰胺凝胶基底培养肿瘤细胞，考察骨架应力状态对NFAT2核内转移和COX-2上调的作用。然后在动物水平上，考察敲低COX-2的表达对悬浮乳腺肿瘤细胞肺转移能力的影响。细胞水平的研究表明，悬浮状态提高乳腺肿瘤细胞内Ca2+含量，提高NFAT2核内转移促进COX-2的表达，促进肿瘤细胞的存活，迁移和侵袭能力。低基质刚度以及细胞松弛素D处理都有利于COX-2的表达，但细胞收缩抑制剂Y27632对COX-2表达无影响。动物实验表明，悬浮状态诱导COX-2通过提高肿瘤细胞在肺的截留和存活从而促进肿瘤转移。
　　本文系统性地研究了悬浮力学状态对乳腺肿瘤细胞转移能力的调控，证明了悬浮力学状态在转录水平和转录后水平可逆地调节相关基因的表达，通过提高乳腺肿瘤细胞的再粘附、迁移、侵袭和存活能力而促进乳腺肿瘤的转移，并初步证实了悬浮引起的细胞骨架改变在其中的力学生物学作用。本文研究结果有助于深入认识悬浮力学状态在乳腺肿瘤细胞转移过程中的重要地位，为靶向Lamin A/C和COX-2的抗转移治疗策略提供理论支持。

目录

英文缩略词对照表

1 绪 论

1.1 问题的提出及研究意义

1.2 国内外现状研究

1.3 课题的研究目的及研究内容

2 悬浮力学状态对乳腺肿瘤细胞再粘附的影响及其机制

2.1 引言

2.2 实验材料与仪器设备

2.3 实验方法

2.4 实验结果

2.5 分析与讨论

2.6 小结

3 悬浮力学状态对乳腺肿瘤细胞存活、迁移、侵袭和体内转移的影响

3.1 引言

3.2 主要实验材料与仪器设备

3.3 实验方法

3.4 实验结果

3.5 分析与讨论

3.6 小结

4 悬浮力学状态对乳腺肿瘤细胞基因表达转录组的调控

4.1 引言

4.2 主要实验材料与仪器设备

4.3 实验方法

4.4 实验结果

4.5 分析与讨论

4.6 小结

5 悬浮力学状态诱导COX-2上调的力学生物学机制及其在乳腺肿瘤细胞转移过程的作用

5.1 引言

5.2 主要实验材料和仪器设备

5.3 实验方法

5.4 实验结果

5.5 分析与讨论

5.6 小结

6 结论与展望

6.1 主要结论

6.2 后续工作展望

致谢

参考文献

附录

A. 作者在攻读学位期间发表的论文目录

B. 作者在攻读学位期间发表的会议论文目录

C. 作者在攻读学位期间参加科研项目目录