三氧化二砷促血管内皮化和抑制支架内再狭窄的生物学机制

摘要

心血管疾病是当前全球发病率和死亡率最高的一类疾病。目前，药物洗脱支架（drug eluting stent,DES）作为治疗狭窄性心血管疾病的主要手段，可大大降低支架内再狭窄的发生。然而，DES所携带的药物（雷帕霉素、紫杉醇等）在发挥上述功能的同时也在一定程度上抑制支架植入损伤部位的再内皮化，从而造成支架内血栓及晚期血栓等灾难性后果。DES引发血栓形成涉及多种机制，其中最重要的原因就是血管内皮化延迟。因此，研发“内皮友好型”的DES—抑制支架内再狭窄的同时促进血管内皮修复—将成为解决该问题的有效策略之一。 我国企业和研究团队自主研发了一种新型药物洗脱支架—三氧化二砷药物洗脱支架（arsenictrioxide-eluting stents,AES）。临床评估显示：该型支架兼具显著抑制支架内再狭窄与有效降低晚期血栓形成的功能，但其作用机制尚未明确。因支架内晚期血栓形成在很大程度上与内皮的修复水平相关，暗示AES很可能具有促进支架植入处血管再内皮化的作用。由此，我们提出“三氧化二砷（arsenic trioxide,ATO）或许是一种内皮友好型的抗再狭窄药物”。为了验证该论点，我们主要开展了如下工作并得出以下结论： 1.AES是内皮友好型药物洗脱支架 将AES与金属裸支架、聚合物涂层金属支架、雷帕霉素药物洗脱支架（rapamycin-eluting stents,RES）等具有代表性的各类主流支架进行对比分析，研究AES支架的安全性及有效性。通过支架形貌观察、血液相容性和生物相容性评估以及组织切片病理分析等实验结果显示：AES支架上的药物涂层均匀、完整，血液相容性良好，对机体主要脏器无明显不良影响。病理切片染色实验结果表明：AES支架能明显抑制支架内再狭窄的发生，并且其性能甚至优于常用药物洗脱支架（RES支架）。 为了研究药物洗脱支架对血管内皮化的影响，我们将植入AES或RES支架1周后的兔颈动脉（连带支架）纵向剪开，通过扫描电镜观察发现AES组的支架处血管再内皮化速度相对更快。利用ECs表面特异性标记物-υWF的免疫荧光抗体分别对植入颈动脉1周的RES和AES（连带血管）纵向切开进行表面染色（en face staining），可见AES组中υWF+细胞呈内皮细胞典型的鹅卵石形状，且AES组中的υWF+细胞数量比RES组增加了近10倍。我们还采用υWF和标记细胞核增殖的Ki67进行免疫荧光双染色并分析了内皮修复层中增殖细胞的类型及数量，其结果显示相较于RES组仅有少量ECs增殖而言，AES组位于新生内膜最内一层的大量ECs均处于增殖状态。以上结果得出，AES可以显著促进支架处血管再内皮化进程，表明AES是一种内皮友好型的药物洗脱支架。 2.线粒体是阐释ATO具有内皮友好作用的潜在机制 为了进一步印证AES是一种内皮友好型的药物洗脱支架，我们利用猪冠状动脉原代内皮细胞和平滑肌细胞进行体外研究。对比检测ATO与多种支架表面常用药物—雷帕霉素、紫杉醇、匹伐他汀、水蛭素和肝素等对ECs和SMCs活性的影响。结果表明仅有浓度为2-6μmol/L的ATO可以兼具抑制SMCs活性并促进ECs活性的功能。JC-1线粒体膜电位检测结果显示，ATO对ECs和SMCs早期凋亡方面的影响亦有差异。以上结果初步得出：ATO可以在促进SMCs凋亡的同时维持甚至增强ECs的活性。 进而，我们仍以猪冠状动脉原代内皮细胞为研究对象，通过细胞增殖、细胞迁移、ECs管状形成、通透性检测以及单核细胞粘附等多个实验研究了ATO对ECs行为及其功能的影响。研究结果表明：2μmol/L ATO可以促进ECs增殖、迁移以及血管成环，同时还具有增强内皮屏障、抑制单核细胞THP-1粘附等功能。这些体外实验结果进一步证实了ATO的内皮友好作用。 我们还通过转录组测序分析了ATO处理对ECs和SMCs基因表达的影响，发现ATO对ECs和SMCs细胞代谢相关基因的表达影响较大。利用MitoTracker线粒体探针示踪以及检测细胞内ATP产生量等实验进一步研究了ATO对ECs和SMCs线粒体结构和功能的影响。结果表明：2μmol/L ATO可提高ECs线粒体的数量，增强其结构完整性，并促进ATP的产生；而对SMCs的作用则相反。这一结果表明ATO可能是通过增强线粒体的结构完整性并促进ATP的产生进而发挥其内皮友好作用的。 3.YAP信号介导SMCs表型转化是ATO抗再狭窄作用的关键 我们以合成型和收缩型SMCs为研究对象，通过细胞活力及凋亡实验、转录组测序分析，免疫荧光染色、蛋白质免疫印迹及原子力显微镜检测等方法体外研究了ATO对SMCs的细胞行为、表型转化及细胞力学的影响。综合以上实验结果表明：ATO可抑制合成型SMCs增殖、促进其凋亡、增强胞内肌动蛋白丝聚集、增加其杨氏模量及提高胞内收缩表型蛋白表达水平等。此外，对血管切片的免疫荧光和免疫组化染色等实验结果进一步得出ATO能够促进并维持SMCs向收缩表型的转化。总之，体外、体内研究相互佐证证实了ATO具有促进合成型SMCs向收缩型转化，并维持其收缩性能的作用。 我们探讨ATO促进SMCs表型转化的机制，我们采用支架植入处的血管标本进行Yes相关蛋白（Yes-associated protein，YAP）和SMCs表型蛋白免疫荧光染色，发现与其它类型支架相比，AES支架在植入早期（1周）即可抑制YAP蛋白进入细胞核，进而调控新生内膜SMCs分化（1个月）并促进其成熟（3个月）。体外细胞骨架F-actin和磷酸化YAP（p-YAP）的免疫荧光双染色结果是p-YAP荧光强度随ATO浓度的增加而增强，且p-YAP的分布与细胞骨架排列密切相关。随后，利用蛋白免疫印迹研究p-YAP与SMCs表型之间的关系，实验结果显示：ATO可以同时增加SMCs收缩蛋白SM22α及p-YAP蛋白的表达；当YAP抑制剂仅使YAP总量发生变化而对p-YAP的表达无显著影响时SM22α的表达变化亦不明显；即使在YAP抑制剂处理条件，ATO的加入仍能增加p-YAP的表达量，并伴随SM22α表达量的增加。由此我们得出：SMCs表型蛋白SM22α的表达与p-YAP的量呈正相关，ATO促进SMCs由合成型向收缩型转化部分一定程度上依赖于YAP通路。 综上，本研究运用基因组学、细胞分子生物学、病理生理学及细胞生物力学等技术和方法，体内和体外研究结果相互印证并证实：ATO具有内皮友好功能以促进内皮化、诱导SMCs表型转化以抑制再狭窄的作用；线粒体结构的完整性及产生ATP的功能是ECs和SMCs对该药物具有不同响应程度的原因，且YAP信号部分介导了ATO促进SMCs由合成型向收缩型的转化。该课题的研究结果加深了我们对ATO抑制支架内再狭窄发生机制的理解，丰富了ATO促进血管再内皮化形成作用的认识，也为以ATO为基础的药物涂层支架等产品的应用与优化提供新的理论支撑。

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