萝芙木（Rauvolfia verticillata（Lour.）Baill.）毛状根外源基因表达系统的建立

摘要

生物碱组成了植物最大的一类天然次生代谢产物，提供了许多具有药用活性的化合物。随着萜类吲哚生物碱代谢途径中一些关键酶基因被克隆，使得利用代谢工程在植物细胞中生产这些生物碱成为可能。萝芙木(Rauvolfiaverticillata(Lour.)Baill.)是夹竹桃科一种重要的药用植物，其根中含有的萜类吲哚生物碱(TIAs)利血平(Reserpine)是目前应用最广泛的抗高血压药物之一。异胡豆苷合成酶(STR)是TIAs合成途径上催化关键步骤的限速酶。本研究将来源于长春花的str基因构建到烟草花叶菜病毒(CaMV35S)启动子驱动的植物双价表达载体，转入带有A4发根农杆菌(Agrobacteriumrhizogenes)Ri质粒，去除武装(disarm)的根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)菌株。以携带有编码STR基因的C58C1菌株为载体，将外源基因str导入萝芙木核基因组，以获得高产利血平的转基因毛状根，并以期利用生物技术手段工业化生产具有活性的次生代谢产物奠定一定的基础，从而解决萝芙木野生资源短缺的问题。 采用叶盘法转化萝芙木外植体，不带外源基因的空白A4转化株作为对照，对发根农杆菌(Agrobacteriumrhizogens)介导的萝芙木遗传转化条件进行了优化。实验结果表明：发根农杆菌菌株在菌液光吸收值为0.6时，致根能力最强。利用无菌的子叶、真叶、茎段以及田间采集的经消毒过的叶片等不同外植体进行遗传转化，真叶的诱导频率最高，为85.71％。预培养2天、共培养3天转化根诱导率最高，达86.67％。100μmol/L乙酰丁香酮(AS)同时加入转化菌液和培养基中转化根诱导率最高，达到83.33％。 对萝芙木毛状根的培养条件进行了筛选：发现在1/2MS+IBA(0.2mg/mL)+NAA(0.1mg/mL)固体培养基上生长最好。后在附加潮霉素20mg/mL的抗性培养基上筛选，初步得到携带有str外源基因的毛状根。 通过聚合酶链式反应(Polymerasechainreaction，PCR)对转化毛状根中ro1b、ro1c基因以及外源基因的检测，确定了str在宿主基因组的整合，进一步证明前面所获得的毛状根为携带有str外源基因的毛状根。 通过HPLC检测毛状根中利血平的含量，结果显示利血平在自然根(种植在田间的萝芙木植株的根)的含量最高达干重的0.026％，空白毛状根(未携带str基因的毛状根)中的含量最高可达千重的0.096％，为自然根中的3.7倍，携带有str外源基因的毛状根中可高达干重的1.367％，为自然根中的52.58倍，且为空白毛状根的14.24倍。因此，此结果有力地证明了str基因是TIAs合成途径上的关键酶基因，是萜类吲哚生物碱代谢工程的必选靶点；具有非常重要的研究意义和商业价值。

目录

文摘

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缩写词表

第一部分文献综述

第二部分引言

第三部分发根农杆菌介导的萝芙木遗传转化体系的建立

第四部分转基因毛状根的分子检测和利血平含量检测

第五部分结论

参考文献

附录

致谢