家蚕微孢子虫孢壁蛋白的分离及主要组分的表达谱分析

摘要

微孢子虫(Protozoan：Mifrosporidia)是一类细胞内专性寄生的单细胞真核生物，广泛寄生于无脊椎动物和脊椎动物，包括人类：是经济昆虫、鱼、兔、产毛动物、啮齿类及灵长类的常见病原。自19世纪发现家蚕微孢子虫以来，不断有新的种类被鉴定，目前已发现有超过150个属，1400多个种。微孢子虫的孢壁蛋白是微孢子虫最直接地与宿主接触的部分，很可能在感染宿主的过程中扮演着重要的角色。本研究在家蚕微孢子虫孢壁蛋白前期研究的基础上，建立了一种新的孢壁蛋白的提取方法，分析了不同方法提取蛋白样品的LC-MS/MS质谱数据，并对三个孢壁蛋白的表达谱进行了分析。主要研究结果如下： 1.纯化孢壳后提取孢壁蛋白(GDGC)法的建立 根据孢子发芽后弹出原生质团的特性纯化孢壳并结合沸水浴法建立了GDGC法(Germination & Density Gradient Centrifugation)，即将发芽后的空孢壳经两次梯度密度离心纯化收集，然后用沸水浴法提取孢壳上的孢壁蛋白，SDS＝PAGE结果显示此法能提取到主要孢壁蛋白SWP30、SWP32、SWP25，但SWP25和SWP32的蛋白丰度较沸水浴法处理的孢子蛋白样品中的含量有所降低，将GDG-C法与新鲜和冷冻孢子沸水浴法得到的蛋白样品、碳酸钾发芽新鲜孢子蛋白样品SDS-PAGE进行比较发现GDGC法的蛋白样品中两个主要孢壁蛋白丰度降低，并能提取到一些新的孢壁蛋白，且蛋白丰度较好。比较得出：此法是一种蛋白来源清楚、较为理想的孢壁蛋白提取方法。 2.不同方法提取孢壁蛋白的比较分析 将沸水浴法、碱溶法分别处理的新鲜和冷冻孢子蛋白样品、SDS法和Brosson法处理的蛋白样品进行SDS-PAGE比较分析得出：碳酸钾发芽的蛋白样品中蛋白含量丰富，含有大量孢内蛋白，不能用来作为孢壁蛋白的有效提取方法。但冷冻孢子经碱液处理时不再发芽，经观察孢子形态完整，此时提取到的蛋白为碱溶性的孢壁蛋白，但蛋白的种类和丰度不高。SDS法处理的样品与以前研究一致只能提取到三个主要孢壁蛋白SWP30、SWP25、SWP32。Brosson法能提取到种类较多的蛋白，但丰度不高，且操作较繁琐、费时。沸水浴法处理新鲜孢子时能提取到35～26KD的5个主孢壁蛋白。(包括SDS法提取到的三个孢壁蛋白)，冷冻孢子样品在26KD处的蛋白有缺失，其它与新鲜孢子样品中的蛋白无异。 3.不同方法抽提孢壁蛋白后的家蚕微孢子虫的形态观察 本研究将不同方法处理后的孢子进行吉姆萨染色，镜检观察其形态变化。发现新鲜孢子经碱溶法处理后均大量发芽，其中0.1M K2CO3和O.1 M KOH处理的孢子发芽率均＞85％，0.01 MKOH处理的孢子发芽率约40％。但孢子经冷冻后再用碱液处理时镜检观察不到发芽现象，且孢子形态完整。沸水浴法和SDS法处理后的新鲜和冷冻孢子形态完整，大小与正常孢子基本保持一致，但处理后的孢子比正常孢子易于着色。 4.家蚕微孢子虫总蛋白质和孢壁蛋白质的质谱分析 将碳酸钾发芽的上清液蛋白质样品，沸水浴法处理的孢子和孢壳的孢壁蛋白样品分别电泳挖胶进行LC-MS/MS分析。质谱数据允析总共获得316个蛋白的信息，按照功能分类主要包括代谢、蛋白靶向、核苷酸合成、蛋白合成、细胞骨架、信号传导、细胞生长分化等方面。孢壁蛋白的质谱分析结果显示找到了12个假定的孢壁蛋白，其中假定孢壁蛋白NbHSWP1～3分别为已鉴定的孢壁蛋白SWP30、SWP25、SWP32。经拷贝数分析发现这12个假定孢壁蛋白在n.bombycis基因组中7个呈单拷贝形式，5个为多拷贝。有3个假定孢壁蛋白在A.locustae和E.cunivuli基因组数据中分别找到了一条相似性序列(相似性在30％～35％之间)，另外在NCBI上进行Protein blast比对后，仅有极少的相似性序列并且相似性很低(均低于30％)，这说明孢壁蛋白具有物种特异性。启动子预测结果显示12个假定孢壁蛋白有三个预测有启动子，且都含有TATA-BOX。对三个孢壁蛋白NbHSWP 1～3的生物信息分析发现它们均有EST数据支持，有磷酸化位点和N-糖基化位点，信号肽长度为17-25个氨基酸，但均没有O-糖基化位点。 5.感染不同时期SWP30、SWP25、SWP32的表达谱分析 以四龄起蚕添毒，添毒量为每头蚕106个孢子，在添毒后12h、24h、36h和2～10d取蚕中肠作为提取RNA的材料，进行家蚕微孢子虫β微管蛋白和三个孢壁蛋白的RT-PCR检测。结果显示β-tubulin基因的转录本从12h起到lod的sseDNA中都能检测到，随着感染时间的增长，从添毒第4d起孢子量明显增多，转录本的量也相应有明显增多趋势。孢壁蛋白SWP30和SWP25从家蚕添食孢子36小时起即孢子进入母孢子也即孢子形成期开始检测到转录本，随着感染时间的增长从3d起转录本的量明显增加随后增长变化不大。SWP32从家蚕添食12小时即在裂殖体时期检测到转录本，但12～36小时的转录本量较微弱，三个孢壁蛋白均在添食n.bombycis 3d后转录本的量明显增加且较β-tubulin增加量明显，这说明孢壁蛋白在孢子母细胞增加到最高时会有大量的转录本生成。这可能与孢壁形成有关。 本研究建立了一种严谨、可靠的提取孢壁蛋白的方法GDGC法，得到了纯度几乎100％的孢壳以提取孢壁蛋白，为孢壁蛋白质组的研究打下基础。获取了三种不同方法提取的蛋白样品的LC-MS/MS数据，经分析找到了12个假定的孢壁蛋白且其中5个为多拷贝基因其它7个为单拷贝，其中3个预测有启动子。假定孢壁蛋白NbHSWP1～3分别为孢壁蛋白SWP30、SWP25、SWP32，它们均有EST数据支持，信号肽长度为17～25个氨基酸，但均没有O-糖基化位点。RT-PCR显示SWP32从添毒12h检测到转录本，SWP30，SWP25从36h检测到转录本。

目录

文摘

英文文摘

声明

第1章文献综述

1.1微孢子虫研究现状

1.1.1微孢子虫的结构

1.1.2微孢子虫的生殖圈

1.1.3微孢子虫的分类和进化地位

1.1.4微孢子虫侵染机制的研究

1.2家蚕微孢子虫的研究现状

1.2.1家蚕微孢子虫的分类

1.2.2家蚕微孢子虫的检测

1.3家蚕微孢子虫蛋白质的研究进展

1.3.1蛋白质组的研究进展

1.3.2家蚕微孢子虫蛋白质的研究

1.3.3家蚕微孢子虫孢壁蛋白质的研究

1.3.4家蚕微孢子虫蛋白质提取方法的研究

第2章绪论

2.1家蚕微孢子虫孢壁蛋白质组的研究背景与意义

2.2主要研究内容

2.3研究技术路线

第3章一种提取孢壁蛋白新方法(GDGC法)的建立

3.1材料

3.1.1家蚕微孢子虫

3.1.2试剂配制

3.1.3使用仪器

3.2方法

3.2.1家蚕微孢子虫原材料的获得

3.2.2家蚕微孢子虫孢壁蛋白质样品的提取

3.3结果与分析

3.3.1孢子壳纯化法提取孢壁蛋白

3.3.2不同方法处理冷冻和新鲜孢子的SDS-PAGE

3.4结论与讨论

第4章不同方法提取家蚕微孢子虫孢壁蛋白后的孢子形态观察

4.1材料

4.1.1家蚕微孢子虫的制备

4.1.2试剂配制

4.1.3仪器

4.2方法

4.2.1家蚕微孢子虫的获得

4.2.2孢子的处理方法

4.2.3孢子的染色法

4.3结果与分析

4.3.1新鲜孢子的不同方法处理结果

4.3.2冷冻孢子的不同方法处理结果

4.4结论与讨论

第5章家蚕微孢子虫蛋白质LC-MS/MS质谱结果分析

5.1材料

5.2方法

5.2.1孢子处理方法及孢子检测方法

5.2.2质谱样品的处理方法

5.3结果与分析

5.3.1 LC-MS/MS样品的制备及检测

5.3.2家蚕微孢子虫总蛋白质组的分析

5.3.3家蚕微孢子虫假定孢壁蛋白质的分析

5.3.4三个假定孢壁蛋白的序列分析

5.4结论与讨论

第6章三个主要孢壁蛋白质SWP25、SWP30、SWP32的表达谱分析

6.1材料

6.1.1家蚕微孢子虫材料的制备

6.1.2试剂

6.1.3仪器

6.2方法

6.2.1家蚕微孢子虫基因组的提取

6.2.2家蚕微孢子虫总RNA的提取

6.2.3家蚕微孢子虫sscDNA的制备方法

6.2.4家蚕微孢子虫三个孢壁蛋白的RT-PCR

6.3结果与分析

6.3.1家蚕微孢子虫总RNA的提取和检测

6.3.2家蚕微孢子虫微管蛋白的RT-PCR

6.3.3家蚕微孢子虫三个孢壁蛋白的RT-PCR结果

6.4结论与讨论

第7章结论与讨论

参考文献

在校期间发表的论文和参加的研究课题

致谢