八棱海棠（Malus robusta Rehd.）和杜梨（Pyrus betulaefolia Bge.）PuNHA基因遗传转化研究

摘要

我国是盐渍土分布广泛的国家，目前有各种盐渍土资源总面积约9913万hm2。同时，我国是一个人口人国，人均资源无论是土地还是水资源都低于世界平均水平。然而我们正面临着人口剧增，耕地锐减的不可逆转的形势。因此人面积盐渍荒地的开发利用和灌区土壤盐渍化的防治是解决21世纪我国粮食问题的一条重要途径，具有重要的实践和理论意义。 苹果是世界四大水果之一，在国内无论栽培面积、产量和消费量均位居水果之首。梨也是世界四人水果之一，是栽培最久的果树之一，寿命长、产量高、果实营养丰富。苹果和梨都是主要以嫁接方式繁殖的果树，砧木对当地土壤环境的适应性在很大程度上决定着果树的成活、地上品种的表现。因此，要在盐碱地栽植果树．首先要选择好耐盐的砧木，否则砧木及其嫁接树的生长都会受到抑制。生产上迫切需要抗性较强的砧小品种。 20世纪80年代发展起来的遗传转化技术为物种遗传改良提供了一种新的技术方法。通过遗传转化技术将耐盐基因导入果树中，培育出耐盐性更强的果树砧木品种。这对于充分利用盐碱地，发展农业，改善环境，为农民创收都是有重要意义的。目前关于果树转耐盐基因的研究只有少量报道，而关于苹果和梨及其砧木转耐盐基因的研究未见报道。 本试验通过高效载体的介导和转基因工程技术，以生产上使用广泛的苹果砧木八棱海棠(Malus robusta Rehd.)和优良的梨树砧木杜梨(Pyrus betulaefolia Bge.)为材料，将PuNHA基因导入其中，并对部分转基因突变体进行PCR、Southern和Northern检测。论文的研究结果如下： 1.以北方盐碱地常用生产上广泛使用的苹果砧木八棱海棠(M.robusta Rehd.)为材料，首次将耐盐基因．PuNHA导入八棱海棠中，并获得了大量转基因八棱海棠突变体。筛选出PuNHA基因转化八棱海棠的除草剂浓度为4 mg/L。以破坏生长点的茎尖组织为外植体转化率最高，转化率为8.7％。八棱海棠PuNHA基冈高效转化体系为：诱导转化芽的配方为：MS+BA4 mg/L+NAA0.2 mg/L+4 mg/L除草剂+500 mg/L羧苄青霉素。转化芽伸长培养基配方为：MS+BA1.5 mg/L+IAA0.3 mg/L4 mg/L除草剂+500 mg/L羧苄青霉素。转化芽生根配方为：1/2MS+IBA0.5 mg/L+4 mg/L，除草剂+500 mg/L羧苄青霉素。 2.对转化苗进行PCR检测，扩增出一条特异的电泳带，该片段为35S启动子的保守序列，由此表明外源基冈已经整合到八棱海棠基因组中；Southem检测了部分转基冈突变体，35S启动子DNA和转化植株DNA均有杂交信号，而未转化植株的DNA无杂交信号，证明PuNHA基因被正确的插入了八棱海棠细胞核基因组；Northern检测了部分转基因突变体，转PuNHA基因八棱海棠mRNA的表达量增加，比野生型即非转基因植株的表达量大，证明PuNHA基因在转基因植株中得到有效表达。 3.八棱海棠在盐浓度为0‰，2‰，3‰，4‰，5‰进行30 d的盐胁迫处理后，经观察分析，在2‰盐胁迫处理下，非转化株与转化株盐害症状不是很明显；在3‰盐胁迫处理下，非转化株的耐盐能力较低，不能在培养基中正常生长，所以使植株生长缓慢，植株矮小，叶片黄化，表现出明显的盐害症状。而转化株在3‰盐胁迫下，植株仍生长正常，叶色浓绿，其优势明显高于非转化株；在4‰和5‰盐胁迫处理下，非转化株与转化株盐害症状比较明显，但是转化株的盐害症状比非转化株轻。由此充分证明八棱海棠在转耐盐基因之后，其耐盐能力有显著提高，由原来的耐盐量2‰，提高到了3‰，其耐盐能力提高了50％。 4.以优良的杜梨砧木(p.betulaefolia Bge.)为材料，获得杜梨的增殖培养基的配方为：MS+BA2.0 mg/L+IAA0.4 mg/L；其幼嫩茎段的再生培养基的配方为：MS+KT3.0mg/L+NA0.3 mg/L+AgN031.0 mg/L；将材料暗培养21 d可显著提高杜梨茎段的再生效率；采用破坏生长点的组织作为外植体诱导再生芽的再生培养基的配方为：MS+KT3.0mg/L，+NAA0.3 mg/L；其生根培养基的配方为：1/2MS+IBA0.5 mg/L。PuNHA基因转化杜梨筛选的除草剂浓度为3 mg/L。 5.首次将耐盐基因PuNHA，导入了杜梨，并获得了部分转基冈杜梨突变体。其转化体系如下：将在再生培养基上暗培养21 d后的幼嫩茎段的愈伤组织和破坏生长点的组织作为外植体，被OD550.值为0.4的农杆菌浸染，转入不含除草剂压力再生培养基上黑暗共培养2 d后，再转入有除草剂压力的筛选培养基(MS+KT3.0 mg/L斗NAA0.3 mg/L+3 mg/L除草剂+500mg/L羧苄青霉素)。通过压力筛选获得的抗性芽为转基因突变体。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略词表

声明

第1章文献综述

1.1盐碱地改良研究进展

1.2耐盐植物育种

1.3耐盐基因工程的研究进展

1.4植物遗传转化

1.5转基因植株的检测

1.6果树基因工程研究现状

1.7转基因技术在苹果和梨上的应用

第2章引言

第3章八棱海棠PuNHA基因转化、筛选、表达及耐盐性鉴定

3.1.材料和试剂

3.2.试验方法

3.3.结果分析

第4章杜梨PuNHA基因的转化

4.1杜梨再生体系的建立

4.2杜梨PuNHA基因的转化

4.3结果分析

第5章讨论

第6章结论

参考文献

附图

致谢

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