药用保护植物黄连种子萌发生理及遗传多样性研究

摘要

黄连(Coptis chinensis Franch．)隶属于毛莨科(Ranunculaceae)，黄连属(Coptis)，为多年生草本植物，具有较大的药用价值。野生黄连在重庆主要分布于石柱、巫山、巫溪和黔江等地区，在四川主要分布在成都周边县市和峨眉地区。目前国内外对黄连的研究主要集中在其药用方面，如化学成分、药理及临床等方面。在当前中医药迅速发展的背景下，对野生药用植物资源的需求量与日俱增，黄连也不例外。为保证黄连药用资源的可持续发展，就不得不对野生资源进行居群遗传学等基础研究。本文以黄连为研究对象，对其种子萌发生理及野生居群遗传多样性进行了研究，旨在探讨野生黄连生存现状与渐危的的主要原因。种子萌发生理方面的研究旨在找到打破种子休眠，促进种子萌发的合理方法，为大面积的种植提供理论依据。采用ISSR分子标记技术对黄连居群的遗传多样性研究，探讨野生黄连日益减少的内在原因，从而为其野生资源的保护、药材的道地性和合理开发利用提供科学依据，具体的结果表明： 1)野生黄连种子的含水量约为14.52％，最高吸水率达到24.50％，吸水饱和时间为6 h，种皮透性良好，不可能是制约种子萌发的因素。生活力测定结果显示有生活力的种子占56％，空粒和无生活力种子占44％，其中空粒种子占28％，说明黄连种子中有很大一部分没有发育完全。 2)萌发实验显示：22℃是野生黄连种子较为适宜的萌发温度，发芽率可达到52.9％。5.0mg·L-1的GA3处理后的萌发率提高最为显著，可达71.2％，但是过高浓度(7.5mg·L-1)的GA3则对种子萌发有一定的抑制效应。通过以上实验，可以得出适度的温度(22℃)和GA3浓度(5.0 mg·L-1)可以显著提高发芽率。黄连的种子生活力低，且种子长期处于休眠，可能是导致黄连致危的重要原因之一。应用正交设计实验研究外源植物激素GA3、NAA、6—BA对黄连种子胚率、裂口率、发芽率的影响；结果表明5号处理组合(5.0 mg/L GA3，0.5 mg/L6—BA，2.5 mg/L NAA)能显著提高胚率、裂口率及发芽率，是促进黄连种子后熟与萌发的最优激素组合。并且用50mmol/L Cacl2处理后其效果要明显优于25 mmol/L Cacl2处理后的效果。 3)通过筛选引物并设定影响黄连ISSR—PCR反应诸因子的不同梯度，检测其不同反应体系的扩增效果，分析非特异性条带的产生原因并进行条件优化，建立黄连ISSR—PCR稳定可靠的反应体系。建立了可用于黄连ISSR—PCR分析的最适宜的反应体系：25μL PCR反应体系中，内含10xPCR Buffer2.5μL，1.5 mmol/LMg2+，200μmol/L dNTP，0.3μmol/L，引物，40 ng模板，1.0 UTaq DNA聚合酶。扩增程序为94℃预变性5 min，然后进行35个循环：94℃变性30 s，(据不同引物退火温度)复性60 s，72℃延伸90 s，循环结束后72℃延伸7 min，4℃保存。所建立的ISSR反应体系具有标记位点清晰、反应系统稳定、检测多态性能力强、重复性好等特点。可以较好地应用于黄连的遗传多样性研究。 4)从ISSR的分析结果来看，野生黄连居群间存在着较为丰富的遗传多样性，多态性检出率为67.92％，这表明黄连具有较高的遗传多样性，并且各居群间的遗传多样性明显低于种水平的遗传多样性，最低的为42.35％，最高的为52.21％。黄连7个居群的Nei's遗传一致度(I)为0.8321～0.9127，遗传距离(D)为0.0894～0.1846。Nei's基因多样性指数(H)范围为0.1619～0.2486，Shannon's多态性信息指数范围(I)为0.2647～0.3021。根据Nei's遗传分化指数估算的7个居群间的遗传分化系数为0.6815，说明居群间遗传变异占总的基因多样性的68.15％，居群内只占31.85％。遗传分化的分析结果显示出：大量的变异主要存在于居群之间，只有少量的变异存在于居群内部。 5)从群落类型与环境条件的综合状况和遗传多样性的角度来看，引起野生黄连日益减少的原因主要不在遗传上，很主要的原因是人为的干扰破坏。为切实保护好国家保护药用植物黄连，实现其资源的可持续利用：建议在人为活动较强的地区，加大宣传力度，有效控制对黄连的采挖；实行就地或迁地活体保存；利用现有的种质资源库或新建专用的药用植物种质资源库，进行种质的低温保存；在种质资源分布集中的地域，建立黄连自然保护区(点)，禁止破坏性利用，防止各种人为干扰，充分发挥黄连群落的生态和经济效益。

目录

文摘

英文文摘

声明

第1章前言

1.1引言

1.2植物保护生物学

1.3种子休眠特性及萌发生理研究

1.3.1种子休眠的原因

1.3.2种子的休眠机理

1.3.3打破休眠的方法

1.4保护植物的遗传多样性研究

1.4.1植物遗传多样性概述

1.4.2植物遗传多样性的研究方法

1.5研究对象及进展

1.5.1黄连的分类地位

1.5.2黄连的形态特征

1.5.3黄连的分布及生态习性

1.5.4黄连研究进展

1.6研究目的及研究意义

第2章黄连种子萌发特性研究

2.1材料与方法

2.1.1材料的收集

2.1.2种子的千粒重

2.1.3种子含水量测定

2.1.4种子吸水量的测定

2.1.5种子活力的测定

2.1.6胚的形态观察

2.1.7种子萌发实验

2.1.8不同化学物质的组合对黄连种子后熟与萌发的影响

2.2结果与分析

2.2.1黄连种子形态和相关的生理指标

2.2.2种子活力的测定及胚的形态结构观察

2.2.3黄连种子的萌发

2.2.4不同化学物质对种子萌发的结果

2.3讨论

第3章黄连的遗传多样性研究

3.1材料和方法

3.1.1材料的收集

3.1.2基因组DNA的提取

3.1.3DNA检测及浓度的测定

3.1.4引物的筛选

3.1.5黄连ISSR反应体系建立与的优化

3.1.6扩增产物的检测与分析

3.2结果与分析

3.2.1基因组总DNA的提取结果

3.2.2 ISSR反应体系的优化结果

3.2.3 ISSR-PCR扩增产物图

3.2.4黄连的遗传多样性

3.2.5黄连不同居群的遗传分化分析

3.2.6黄连不同居群的聚类分析

3.3讨论

3.3.1基因组DNA的提取

3.3.2 ISSR反应体系的优化

3.3.3 ISSR遗传多样性分析

3.3.4黄连的遗传分化

第4章结论

参考文献

附图

致谢

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