高羊茅(Festuca arundinacea Schreb.)高频再生体系的建立及转基因初探

摘要

高羊茅(Festuca arundinacea Schreb)系禾本科羊茅属多年生冷季型草，因其具有建坪快，抗旱，耐高温，耐践踏，适应多种土壤和气候条件等特点，而被广泛应用于运动场、园林绿化、机场和斜坡防护等。但在运用过程中也存在一些不足之处，如叶片较粗糙，没有匍匐茎，草坪扩展性差，夏季生长缓慢等。本实验的目的是以高羊茅(新秀和夜明珠2号)的成熟种子为试材，采取切除部分胚乳的方法，利用组织培养技术，对愈伤组织和不定芽的形成进行研究，建立高羊茅稳定、高频的再生体系；同时采用根癌农杆菌浸染方法，探讨影响转化的因素，初步建立起高羊茅(夜明珠2号)的遗传转化系统，为其诱变育种，细胞工程操作和基因工程操作奠定基础，从而促进品种改良，使其更好地用于生产。实验结果如下： 1.建立以成熟种子为外植体的高频再生体系 以高羊茅新秀和夜明珠2号两品种的成熟种子为外植体，研究了不同植物生长调节剂种类组合及浓度的配比对愈伤组织诱导、分化的影响，结果表明：含生长素2,4-D、NAA和细胞分裂素6-BA的诱导培养基对两品种愈伤组织的诱导频率差别较大，诱导率幅度范围分别为9～92％、12～94％，两品种对2,4-D敏感性很强，夜明珠2号以5.0mg/L2,4-D+0.1mg/L6-BA效果最好，愈伤组织诱导率达到92％：新秀以5.0mg/L2,4-D+0.1mg/L6-BA和5.0mg/L2,4-D+0.1mg/LNAA效果较好，但前者的愈伤组织诱导率较后者大，可达94％；6-BA对愈伤组织的分化起着重要作用，夜明珠2号以2.0mg/L6-BA分化效果最好，新秀则以1.0mg/L6-BA效果最好，分化率分别高达。78％和76％；两品种最佳的生根培养基均为1/2MS+0.5mg/LNAA，生根率可达100％。 2.初步建立了以愈伤组织为受体的高羊茅(夜明珠2号)遗传转化体系 在高羊茅遗传转化过程中，对影响其转化效率的因素进行了比较详细的试验，初步建立了高羊茅的遗传转化体系。根据本次实验结果统计，确定转化最优条件如下：将诱导30d的愈伤组织在MS+0.5mg/L6-BA+0.5mg/LNAA中预培养2～3d备用；取对数生长期OD值为1.0左右的农杆菌菌液离心，再用液体MS重悬至OD值为0.6～0.7，同时加入100umol/L乙酰丁香酮，浸染预培养愈伤组织10～15min，滤纸吸干多余的菌液，接种于MS+5.0mg/L2,4-D+0.1mg/L6-BA+100umol/LAS的共培养基中(培养基上添加滤纸)，暗培养3～4d：液体MS清洗二次，MS+500mg/LCef脱菌2h，转入MS+5.0mg/L2,4-D+0.1mg/L6-BA+30mg/LCef中进行延迟培养，2～3d后，转入MS+5.0mg/L2,4-D+0.1mg/L6-BA+20mg/LG418+100mg/LCef诱导筛选培养基中培养，待分化出抗性愈伤组织后，即转入MS+1.0mg/L6-BA+30mg/LG418+100mg/LCef的分化筛选培养基中培养，待长出3～4cm的幼苗时，转入1/2MS+0.5mg/LNAA+30mg/LG418的生根筛选培养基中诱导生根。得到2株GUS+染色呈蓝色的抗性苗。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略词表

声明

第1章文献综述

1.1高羊茅概况

1.1.1高羊茅的植物学特性

1.1.2高羊茅的生物学特性

1.1.3高羊茅的应用和发展前景

1.2草坪草育种研究概况

1.2.1传统育种与组织培养技术

1.2.2草坪草组织培养技术的种类

1.2.3高羊茅组织培养研究进展

1.3转基因技术在草坪草中的应用

1.3.1原生质体DNA直接吸入法

1.3.2基因枪法

1.3.3碳化硅纤维介导转化法

1.3.4农杆菌介导转化法

1.4影响草坪草转基因的因素

1.4.1再生体系

1.4.2转化细胞的筛选和检测

1.5转基因过程中存在的问题及解决对策

1.5.1体细胞无性系变异

1.5.2转基因效率

1.5.3转基因植株的稳定性

1.5.4转基因对环境的影响

1.5.5转入的基因

1.6高羊茅转基因技术的研究

1.6.1选择压的确定

1.6.2受体材料感受态的获得

1.6.3外植体的预培养

1.6.4浸染条件的选择

1.6.5共培养条件的选择

第2章引言

第3章材料与方法

3.1实验材料

3.1.1植物材料

3.1.2菌株和质粒

3.1.3主要仪器设备及试剂

3.1.4常用试剂

3.1.5基本培养基

3.2实验方法

3.2.1培养条件

3.2.2无菌材料的获得

3.2.3再生体系的建立

3.2.4转化方法和转化条件的研究

3.2.5转基因植株的检测

第4章结果与分析

4.1高羊茅(夜明珠2号与新秀)再生体系的优化

4.1.1不同植物生长调节剂组合对愈伤组织诱导的影响

4.1.2外植体的不同处理方法对愈伤组织诱导的影响

4.1.3不同植物生长调节剂组合对愈伤组织分化的影响

4.1.4不同植物生长调节剂组合对高羊茅生根的影响

4.2遗传转化体系的建立

4.2.1 G418选择压的确定

4.2.2 G418对生根的影响

4.2.3 Cef抑菌浓度的确定

4.2.4 Cef对愈伤组织诱导的影响

4.2.5预培养时间对转化的影响

4.2.6浸染液对转化的影响

4.2.7农杆菌浸染时间对转化的影响

4.2.8不同共培养因素对转化的影响

4.2.9添加乙酰丁香酮(AS)对转化的影响

4.2.10延迟筛选培养对转化的影响

4.2.11 gus基因瞬时表达的检测

第5章讨论

5.1高羊茅高频再生体系的建立

5.1.1外植体的选择

5.1.2植物生长调节剂对高羊茅愈伤组织诱导的影响

5.2影响遗传转化体系建立的冈素探讨

5.2.1高羊茅对G418和Cef的敏感性

5.2.2预培养对转化的影响

5.2.3共培养因素对转化的影响

5.2.4乙酰丁香酮的使用

5.2.5延迟筛选培养对转化的影响

第6章小结

6.1高羊茅高频再生体系的建立

6.1.1高羊茅愈伤组织的诱导

6.1.2高羊茅愈伤组织的分化

6.1.3高羊茅幼苗的生根

6.2高羊茅遗传转化体系的初步探讨

参考文献

致 谢

在学期间发表文章