内源性抗菌肽基因的过量表达对家蚕抗病力影响的研究

摘要

昆虫抗菌肽是昆虫免疫诱导产生的一系列小分子多肽，对昆虫的抗病能力起着重要的作用。昆虫抗菌肽具有杀菌能力强、抗菌谱广等特点，而引起人们的普遍关注。家蚕作为支撑蚕丝产业的重要经济昆虫，因此提高其抗病性的研究对提高蚕丝生产有着重要的意义。家蚕是鳞翅目昆虫中的模式生物，国内外研究者已经对家蚕的抗菌肽做了大量的研究工作，发现家蚕中存Cecropin、Moricin、Attacin、Defencin、Gloverin、Lebocin这六大类抗菌肽基因，这些基因对家蚕的抗病能力应该发挥着重要的作用。近年来，随着基因工程技术的发展，通过转基因手段培育抗病性强的新品种成为新的育种研究方向，人们把昆虫抗菌肽基因导入动植物染色体，已经获得了抗病性强的转基因动植物，为选育高抗性的动植物品种作出了重要的探索。 本研究基于本实验室构建的家蚕转基因技术平台，选择对革兰氏阳性菌与革兰氏阴性菌有抗菌活性的家蚕Moricin2基因(NCBI LOCUS:AB006915.1)和对革兰氏阴性菌有抗菌活性的家蚕Lebocin3基因(NCBI LOCUS:AB003035)，构建转基因表达载体并导入家蚕基因组中，探索转内源性抗菌肽基因后对家蚕抗菌能力和生长发育的影响。本研究获得的如下结果： 1.抗菌肽转基因表达载体的构建 将主要在家蚕脂肪体表达的SDH启动子与Morcin2基因构建成融合转基因表达载体pBac[3×P3-EGFP+SDH-Mor]；将Lebocin3基因分别与SDH启动子或在家蚕全身广谱表达的IE1启动子构建成两个融合转基因表达载体，即pBac[3×P3-DsRed+IE1-Leb]和pBac[3×P3-DsRed+SDH-Leb]。 2.转基因蚕的制作与分子检测 将构建好的pBac[3×P3-EGFP+SDtt-Mor]、pBac[3×P3-DsRed+IE1-Leb]和pBac[3×P3-DsRed+SDH-Leb]3个转基因表达载体通过蚕卵显微注射后，在G1代进行荧光筛选，分别得到40、30、36头荧光蚕。 对每个阳性转基因家蚕品系随机抽取一个个体进行Southern blot检测，分析结果表明，目的基因表达盒都已经整合到家蚕基因组上，即成功构建了SDH-Mor、IE1-Leb和SDH-Leb转基因系。 3.转基因家蚕中Moricin2和Lebocin3抗菌肽基因的表达分析 抽提3个转基因系和对照的脂肪体总RNA，合成cDNA后进行半定量RT-PCR检测，结果表明：(1)SDH-Mor和对照脂肪体中Moricin2基因mRNA的相对表达量分别为0.72±0.018和0.43±0.0093，Moricin2基因mRNA相对表达量提高差异极显著；(2)IE1-Leb、SDH-Leb和对照脂肪体中Lebocin3基因mRNA的相对表达量分别是0.73±0.015、0.71±0.017和0.42±0.0091，两个转基因系中Lebocin3基因mRNA的相对表达量比对照显著提高，但是两个转基因系间差异不显著。 4.转基因蚕的抗菌能力分析和生长发育情况观察 对SDH-Mor转基因系和对照2龄起蚕添食苏云金芽孢杆菌，试验结果表明，当苏云金芽孢杆菌浓度为1.25×108个/mL，时，SDH-Mor转基因系比对照对苏云金芽孢杆菌的抗性提高了约24.4％。 对IE1-Leb转基因系和SDH-Leb转基因系与对照2龄起蚕添食E.coli，实验结果显示，当E.col浓度为1.4×109个/mL时，IE1-Leb转基因系和SDH-Leb转基因系对E.coli的抗性比对照分别提高了约20.57％和13.9％。 对转基因家蚕的生长发育情况进行观察，没有发现明显的异常现象。

目录

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第一章文献综述

1.1家蚕抗菌肽的种类

1.1.1 Cecropin

1.1.2 Attacin

1.1.3 Lebocin

1.1.4 Moricin

1.1.5 Gloverin

1.1.6 Defencin

1.2抗菌肽基因的活化机制

1.2.1 Toll途径

1.2.2 IMD途径

1.3抗菌肽的作用机制

1.4抗菌肽的应用

1.4.1抗菌肽在动植物抗病基因工程中的应用

1.4.2抗菌肽在医药方面的应用

1.4抗菌肽应用中存在的问题

第二章引言

2.1研究目的及意义

2.2研究内容

1.转基因表达载体的构建

2.转基因蚕的制作与检测

3.转基因家蚕相关抗菌肽基因的表达分析

第三章 抗菌肽转基因表达载体的构建

3.1材料

3.2主要试剂与仪器

3.2.1主要试剂

3.2.2主要溶液及配制

3.2.3主要设备

3.3方法

3.3.1感受态细胞的制备

3.3.2 PCR产物、酶切产物的回收

3.3.3目的片段与载体连接

3.3.4转化

3.3.5质粒DNA的制备

3.3.6 RNA的抽提、检测及反转录

3.3.7引物设计

3.3.8 PCR 反应

3.3.9酶切

3.3.10基因组DNA的提取

3.3.11 1％琼脂糖凝胶制备

3.3.12双链DNA 5'末端突出的Klenow补平

3.3.13 CIP去磷酸化处理

3.4结果与分析

3.4.1目的片段的克隆

3.4.2 pBac[3×P3-EGFP+SDH-Mor]转基因表达载体的构建

3.4.3 pBac[3×P3-DsRed+IE1-Leb]转基因表达载体的构建

3.4.4 pBac[3×P3-DsRed+SDH-Leb]转基因表达载体的构建

3.5小节与讨论

第四章 转基因蚕的制作与分子检测

4.1材料

4.2主要试剂和主要设备

4.2.1实验试剂

4.2.2主要仪器

4.3实验方法

4.3.1用于显微注射质粒的提取

4.3.2蚕卵显微注射

4.3.3阳性转基因蚕的荧光筛选

4.3.4基因组的提取

4.3.5阳性转基因家蚕的Southern blot检测

4.4结果与分析

4.4.1抗菌肽转基因蚕的制作与荧光检测

4.4.2 SDH-Mor转基因蚕的Southern blot检测

4.4.3 IE1-Leb和SDH-Leb阳性转基因蚕的Southern blot检测

4.5小节与讨论

第五章转基因家蚕相关抗菌肽基因的表达分析

5.1材料

5.2主要试剂和主要设备

5.2.1实验试剂

5.2.2主要仪器

5.3实验方法

5.3.1 RNA的抽提、检测及反转录

5.3.2 RT-PCR

5.3.3 PCR电泳条带光密度扫描

5.3.4方差分析

5.4结果与分析

5.4.1总RNA的提取及反转录

5.4.2半定量RT-PCR循环数的确定

5.4.3半定量RT-PCR

5.4.4小节与讨论

第六章 转基因蚕的抗菌能力分析

6.1材料

6.2主要仪器与试剂

6.2.1主要试剂

6.2.2主要仪器

6.3实验方法

6.2.1细菌培养及其处理

6.3.2对家蚕添食细菌

6.3.3方差分析

6.4结果与讨论

6.3.1 SDH-Mot转基因蚕抗苏云金芽孢杆菌试验

6.3.2 IE1-Leb和SDH-Leb转基因蚕抗E.coli试验

6.4.3讨论

第七章总结与展望

7.1总结

7.2展望

参考文献

附录

发表文章与参研课题

致 谢