利用RNAi阻抑Bax inhibitor-1（bi-1）基因表达并诱导人鼻咽癌细胞凋亡的研究

摘要

【目的】 鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma，NPC)是我国华南地区的高发性恶性肿瘤，研究表明其发病除与EB病毒感染、化学致癌物有关外，与遗传易感基因也有密切的关系。近年来，RNA干扰(RNA interference,RNAi)的研究进展非常迅速，这项技术极有可能用于肿瘤临床治疗。本课题拟从基因治疗的角度，以进化保守的凋亡抑制基因bi-1为靶点，针对bi-1基因设计并构建表达shRNA的质粒载体，利用Lipofectaminea<'TM>2000(Lip)有效地将其转染至鼻咽癌细胞内，诱导序列特异性的基因沉默，旨在研究RNAi效应对人鼻咽癌低分化细胞株CNE-2Z和高分化细胞株CNE-1 bi-1基因表达的抑制作用及其对细胞增殖抑制和凋亡诱导作用，探讨鼻咽癌新的治疗策略。 【方法】 根据人bi-1基因序列及二级结构特征，借助网上siRNA设计工具，寻找bi-1基因编码序列(CDS)中4个可能的干扰位点(长度为27nt)，经BLAST确定与其它基因不存在同源性。人工合成5对正反义脱氧寡核苷酸链，退火、定向克隆入含小鼠U6(mU6)启动子的真核表达质粒载体pmU6中，构建表达shRNA的系列重组质粒载体，研究其产生的shRNA抑制bi-1基因表达的效果，并观察其诱导鼻咽癌细胞凋亡的情况。琼脂糖凝胶电泳法初步筛选正确的重组克隆，DNA测序验证重组克隆的正确性；流式细胞术(FCM)检测转染率；MTT 法观察质粒载体及转染试剂对CNE-2Z 和 CNE-1 生长增殖的影响；FCM 检测细胞凋亡；RT-PCR法分析表达shRNA重组质粒载体对bi-1基因mRNA表达的抑制效应，通过上述实验从4条27nt siRNA 候选序列中筛选出1条活性高、特异性强的序列。以筛选出的27nt siRNA序列为基础，设计相应的19、23、29nt siRNA序列，构建相应的重组质粒并进行DNA测序鉴定。MTT 法检测重组质粒载体对鼻咽癌细胞生长增殖的抑制效应；Hoechst33258/PI 双染色荧光显微镜观察鼻咽癌细胞形态学的变化；FCM和DNA ladder检测细胞凋亡；RT-PCR、Westem-blot分析重组质粒载体对有关基因mRNA和蛋白质表达的抑制效果 【结果】 DNA测序结果证实各重组质粒(含 27nt siRNA)的插入转录模板完全正确。Lip 对质粒的转染率为 50％～60％。分别转染5种含 27nt siRNA 的重组质粒后，CNE-2Z和CNE-1 细胞的生长增殖能力降低；bi-1，mRNA 水平有不同程度的下调；凋亡细胞有所增加。与其它重组质粒比较，pmU6-bi-1-4 质粒的干扰效果显著，差异有显著统计学意义(P<0.01)。 与pmU6-bi1-19和pmU6-bi-1-23重组质粒相比，pmU6-bi-1-29和pmU6-bi-1-27质粒在抑制细胞生长增殖和诱导凋亡等方面效果明显，差异有显著统计学意义(P<0.01)。转染 pmU6-bi-1-29重组质粒48h后，荧光显微镜下可见部分鼻咽癌细胞出现典型的凋亡形态学变化；DNA 凝胶电泳图谱出现“梯状”条带；可明显下调bi-1、bel-2、bcl-xL、survivin的mRNA和蛋白表达水平；面caspase-3、-12的mRNA水平上调，蛋白水平下调：未处理组细胞中上述基因的mRNA和蛋白水平均无明显变化。 【结论】 成功构建了针对人bi-1基因的shRNA真核表达质粒。构建的重组质粒能特异、有效地阻抑bi-1基因表达，但其不能使bi-1基因完全沉默，且不同的siRNA序列下调bi-1基因表达的效率不同：比较具有相同长度的siRNA序列，位于基因尾部的位点干扰效果较好；针对同一位点设计不同长度的siRNA序列，当长度<30nt 时，较长的siRNA序列具有较好的干扰效果。表达针对bi-1 shRNA的重组质粒可显著下调bi-1基因mRNA和蛋白表达水平并可诱导人鼻咽癌细胞凋亡。在阻抑bi-1基因表达，诱导人鼻咽癌细胞凋亡的过程中，bel-2、bel-xL、survivin、caspase-3、-12的表达也发生了一定的变化，但阻抑bi-1基因表达诱导鼻咽癌细胞凋亡的机理有待于进一步的研究。

目录

声明

1前言

1.1研究背景

1.2研究目的

1.3研究内容

2针对bi-1的shRNA表达质粒(含27nt siRNA)的构建、鉴定及筛选

2.1材料与方法

2.2结果

2.3讨论

3 pmU6-bi-1系列质粒RNAi作用的特异性研究(筛选含27nt siRNA最佳作用质粒)

3.1材料与方法

3.2结果

3.3讨论

4含不同长度siRNA(19、23、27、29nt )的表达质粒对bi-1基因沉默效率的影响

4.1材料与方法

4.2结果

4.3讨论

5 pmU6-bi-1-29质粒诱导人鼻咽癌细胞凋亡及其机理的初步研究

5.1材料与方法

5.2结果

5.3讨论

6小结

参考文献

文献综述　进化中保守的凋亡抑制因子Bax inhibitor-1

致谢

附录