应用real-time RT-PCR研究柑桔衰退病毒弱毒株对强毒株的拮抗作用

摘要

柑桔是世界第一大水果，总产量1.2亿吨左右。2007年我国柑桔种植面积和产量均跃居世界第一。由柑桔衰退病毒(Citrus tristeza virus，CTV)引起的柑桔衰退病是世界范围内一种重要的病害，在我国分布也极为普遍。目前对该病的主要防治措施包括弱毒株交叉保护(Mild Strain Cross Protection，MSCP)技术来防治茎陷点型衰退病。
　　 本研究在锦橙植株预先嫁接接种CTV弱毒株CT 11之后第7个月，使用褐色橘蚜(25头/株)进行CTV强毒株CT14拮抗接种试验。分别在拮抗接种15、30、45、60及90天后采用微量Trizol法抽提总RNA，同时在柑桔18S rRNA及nad5两个内参基因共同校正的基础上，运用real-time RT-PCR(real-time fluorescence quantitative RT-PCR，实时荧光定量RT-PCR)技术对供试植株体内CTV强弱毒株的含量变化进行监测。本研究结果将有助于揭示MSCP防治CTV的机理。主要研究结果如下：
　　 1)嫁接接种后6个月内弱毒株的p25基因在甜橙中表达的高峰期存在差异。随着时间和季节推移，CTV的量会出现波动过程。
　　 2)当25头蚜虫接种CTV强毒株CT14至两年生无毒锦橙实生苗(正对照)后15至60天，供试植株的叶/皮可陆续检测出CTV。整个拮抗试验中大多数植株皮中CTV含量比叶中的含量更高。然而蚜虫接种正对照的嫩梢时发现，一半植株中嫩叶比嫩皮更早检测到CTV，而且多数植株的嫩叶中CTV含量比皮更早达到高峰。但最终在大多数植株中CTV在皮中的含量高于叶中CTV的含量。
　　 3)预免疫植株在褐色桔蚜拮抗接种后十个月仍未能检测到强毒株CT14。表明在25头蚜虫攻毒压力下，弱毒株CT11能够有效的阻止强毒株CT14的侵入或增殖，对甜橙植株起到很好的保护效果。
　　 4)预免疫植株在拮抗接种45天内其多数样品内(10/14，7个植株的叶和皮)弱毒株CT11的相对表达量迅速升高，且高于负对照植株体内CT11的相对表达量。在45天后拮抗植株内CT11的含量有所下降或者与负对照差异不大。
　　 5)18S rRNA和nad5内参基因的表达基本上稳定。两个内参分别校正后CT11的变化趋势基本一致。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略符号表

声明

第1章 文献综述

1.1柑桔衰退病对我国柑桔产业的威胁

1.2柑桔衰退病毒的生物学特征

1.2.1柑桔衰退病毒的分类地位

1.2.2柑桔衰退病毒的症状

1.2.3柑桔衰退病毒的寄主范围和敏感性

1.2.4柑桔衰退病毒的传播途径

1.2.5柑桔衰退病毒的传播方式

1.2.6橘蚜的传毒特性

1.3柑桔衰退病毒的分子生物学特性

1.4柑桔衰退病毒的检测

1.4.1指示植物鉴定

1.4.2血清学检测技术

1.4.3常规RT-PCR及限制性片段长度多态性分析(RFLP)

1.4.4实时荧光定量PCR(real-time PCR)的原理及在柑桔衰退病上的运用

1.5柑桔衰退病毒在植株内含量的时序变化

1.6柑桔衰退病毒的防治策略及弱毒株交叉保护

1.7小结

第2章 引言

第3章 应用real-time RT-PCR监测柑桔衰退病毒体系的建立及优化

3.1试验材料

3.1.1毒源及植物材料

3.1.2主要试剂

3.1.3主要仪器

3.2试验方法

3.2.1总核酸及总RNA的抽提

3.2.2引物的设计与筛选

3.2.3 Real-time RT-PCR条件的优化

3.2.4扩增效率的验证及数据分析

3.3结果与分析

3.3.1总RNA的抽提质量

3.3.2引物筛选

3.3.3 Real-time RT-PCR的条件优化

3.3.4内参基因的稳定性

3.4讨论

3.5小结

第4章 应用real-time RT-PCR监测柑桔衰退病毒弱毒株的拮抗效果

4.1材料

4.1.1毒源及植物材料

4.1.2供试蚜虫

4.1.3试验试剂

4.1.4试验设备

4.2试验方法

4.2.1嫁接接种弱毒株CT11的检测

4.2.2拮抗试验

4.2.3 Real-time RT-PCR监测CT11与CT14含量的时序变化

4.2.4数据分析

4.3结果与分析

4.3.1嫁接接种弱毒株的检测结果

4.3.2嫁接接种弱毒株后应用real-time RT-PCR监测CT11含量的时序变化

4.3.3蚜虫接种正对照植株后应用real-time RT-PCR监测CT14含量的变化

4.3.4两个内参基因分别校正CT11的相对表达量的比较

4.3.5蚜虫拮抗接种后应用real-time RT-PCR监测强弱毒株的含量变化

4.3.6症状观察

4.4讨论

4.5 小结

第5章 展望

参考文献

附录1 常用储备液及缓冲液

致谢

参与课题与发表文章目录