乙烯诱导柑橘果实脱落的转录基因组学研究及乙烯诱导基因的克隆和鉴定

摘要

果实脱落是影响柑橘产量的重要因素之一。乙烯调节脱落过程中细胞分裂、伸长、细胞壁水解等多种细胞学、生物化学进程，是主要的脱落激素。乙烯生物合成途径已经阐明。研究指出，柑橘叶片和果实中都存在两种乙烯生成系统，柑橘叶片在采摘后(老叶3-5天、新叶6-7天)乙烯合成表现为系统Ⅰ，老叶采后5天、新叶采后7天则表现出乙烯自动催化等典型的类似跃变型果实的乙烯生成系统Ⅱ的特征；柑橘作为一种非跃变型的果实，成熟果实中只有系统Ⅰ存在，外源乙烯能促进成熟相关的色素变化加快呼吸进程；但在幼果中表现出乙烯生成系统Ⅱ类似的特征。为探寻乙烯在柑橘成熟果实脱落过程中的作用机理，本研究进行了乙烯诱导下柑橘果实离层的表达谱分析，柑橘PRP、ERF和半胱氨酸蛋白酶基因全长cDNA克隆、表达分析和柑橘PRP、ERF、半胱氨酸蛋白酶基因RNAi载体的构建及转化等研究。
　　 1.乙烯诱导下柑橘果实离层的表达谱分析
　　 利用Citrus Genome Array研究了在外源乙烯(20μL/L)诱导下柑橘果实离层的基因表达谱，在30395个达到探针对阀值(8对)要求的探针组中，检测到20639探针组对应的基因表达。应用GCOS软件系统进行数据管理、RMA进行数据预处理、随机方差模型的单因素方差分析法分析实验组与对照组间的差异基因之后，发现在FDR(false-discovery rate)≤0.02水平上乙烯处理4h、24h后分别有569和356条基因表达量的变化倍数≥4。其中，4h乙烯处理后表达量上调的有243条，处理24h后上调表达的有176条；而对应时间内表达量下调的则分别有326条和190条。分析了随机挑选的16条基因，所得结果与芯片数据高度一致。根据基因功能分类，发现这些乙烯应答基因涉及协迫应答、生物或非生物刺激、蛋白质代谢、物质转运、信号转导和转录等多种生物学过程。经过基因本体(Gene Ontology,GO)分析，差异表达基因中，发现富含羟脯氨酸蛋白-4(PRP4，proline-fich protein4)基因、乙烯响应因子1(ERF1，ethylene response factor1)基因和半胱氨酸蛋白酶(CysP,cysteine proteinase)基因高度受到乙烯调控，它们在柑橘果实脱落中所起的作用值得关注，因而被挑选出来进一步分析。
　　 2.柑橘CsPRP4、CsERF1、CsUnknow和CsCysP基因全长cDNA克隆和表达分析
　　 根据HarvEst Citrus(Version1.25)数据库提供的CsPRP4、CsERF1、CsUnknow和CsCysP序列信息设计了PCR引物，采用RT-PCR和SMART RACE技术和克隆操作，获得了这些基因的全长cDNA序列。
　　 序列分析结果显示，这4个基因的全长cDNA长度分别是1251bp、1453bp、1545bp和1452bp，开放阅读框(ORF)的长度分别是585bp、810bp、1101bp和1050bp，分别编码194、269、365和347个氨基酸，相应的推测分子量分别是20.79KD、29.25KD、41.6KD和38.4KD。蛋白理化性质分析表明CsPRP4和CsERF1性质稳定，而CsUnknow和CsCysP不稳定。
　　 生物信息学和基因差异表达分析表明：CsPRP4是受外源乙烯诱导表达量上升最强烈的编码细胞壁蛋白的基因，在叶片和果实离层均表达，受乙烯诱导后的叶片和果实离层表达存在差异；CsERF1是AP2超基因家族成员，具转录因子活性，在乙烯诱导下表达量大量增加，CsERF作为乙烯信号转导途径的中间组分，具有结合GCC-box的活性，通过与乙烯应答基因启动子中的GCC-box结合调控下游基因表达，可能是最终导致脱落的关键因子之一；CsUnknow基因，定位于内膜系统，具有GCC-box结合域，受乙烯强烈诱导，功能未知；CsCysP蛋白，是重要的水解蛋白酶之一，具有肽链内切酶活性，是一种跨膜蛋白，定位于液泡膜上。外源乙烯作用下，CsCysP在柑橘果实离层中受到强烈抑制，推测其负调控下游的脱落相关基因，受其作用的某些蛋白质的积累可能是脱落过程所必须的。
　　 3.柑橘CsPRP4、CsERF1和CsCysP基因RNAi载体的构建及转化
　　 采用RT-PCR方法扩增柑橘目的基因PRP4、ERF1和CysP的cDNA片段，连接到TA克隆载体。双元载体pFGC5941和目的基因的克隆经限制性内切酶两次双酶切，将目的基因片段按正、反向插入到pFGC5941查耳酮合成酶内含子的两端，构成反向重复序列，即RNA干涉载体。通过菌液PCR、酶切检验或测序等证实正、反向基因片段均已正确插入到载体中。研究中保留了采用该法构建的全长正向片段与pFGC5941相连接后得到的产物，以用于基因的过量表达研究。采用根癌农杆菌介导的转基因法得到了大量抗性芽，其中部分已经嫁接成活，为下一步研究在干扰和过量表达这些基因后的表型打下了基础。
　　 4.主要结论
　　 本实验在转录水平上大规模地研究了外源乙烯诱导下柑橘果实离层的基因表达谱的变化，获得了大量潜在的参与脱落进程的基因及其表达数据。在全面综合分析这些数据的基础上，基本明确了参与脱落过程的生理生化过程，加深了对乙烯在诱导柑橘果实脱落过程中基因调节等分子机理的认识。
　　 克隆获得了4条在柑橘果实脱落过程中受到强烈调控的基因CsPRP4、CsERF1、CsUnknow和CsCysP的全长cDNA。对这些基因进行了生物信息学分析，结合表达分析，推测了其在脱落过程中可能的作用。
　　 构建了CsPRP4、CsERF1、CsUnknow和CsCysP基因的过量表达载体和RNAi载体。通过根癌农杆菌介导的遗传转化，获得了大量抗性再生芽，部分芽已高接成活，为下一步揭示这些基因的功能奠定了基础。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一章文献综述

1.1基因芯片技术在柑橘研究中应用

1.1.1基因芯片分析技术基本原理

1.1.2柑橘基因芯片及其应用研究概况

1.2柑橘脱落相关基因的研究进展

1.2.1乙烯的生物合成及信号转导

1.2.2乙烯的信号转导元件

1.3柑橘基因组学研究

1.3.1全基因组测序

1.3.2柑橘的专业数据库

1.3.3柑橘蛋白组学

1.4 PRPs、ERF和CysP基因功能概述

1.4.1 PRPs基因的功能

1.4.2 ERF1基因的功能

1.4.3 CysP基因的功能

第二章引言

2.1研究的目的与意义

2.2主要技术路线图

第三章芯片杂交及数据与分析

3.1实验材料及与主要试剂、仪器设备

3.1.1植物材料

3.1.2乙烯处理

3.1.3样品处理

3.1.4 RNA提取所需试剂及主要设备

3.1.5芯片选择

3.1.6RTQ-PCR所需试剂及仪器

3.1.7差异表达基因的生物信息学分析

3.2实验方法和操作步骤

3.2.1总RNA提取

3.2.2 RNA质量检测

3.2.3芯片杂交

3.2.4 RTQ-PCR验证芯片杂交数据

3.3结果及数据分析

3.3.1样品RNA质量分析

3.3.2芯片杂交质量控制

3.3.3杂交数据验证RTQ-PCR验证

3.3.4芯片数据分析

3.3.5差异表达基因的功能分析

3.4讨论

3.4.1乙烯的生物合成和感知

3.4.2转录因子

3.4.3信号传导

3.4.4乙烯通路中差异表达的基因

第四章CsPRP4、CsERP1、CsUnknow，和CsCysP基因的克隆、表达和分析

4.1实验材料及与主要试剂、仪器设备

4.1.1植物材料

4.1.2叶片乙烯处理

4.1.3果实乙烯处理

4.1.4菌株和载体

4.1.5主要仪器设备

4.1.6试剂盒及试剂

4.2实验方法及步骤

4.2.1基因克隆技术基本操作

4.2.2反转录RT-PCR

4.2.3 CsPRP4、CsERF1、CsUnknow和CsCysP基因的全长cDNA克隆

4.2.4 CsPRP4、CsERF1、CsUnknow和CsCysP基因的差异表达分析

4.2.5生物信息学分析

4.3结果与分析

4.3.1 RACE-cDNA的获取

4.3.3 CsPRP4、CsERF1、CsUnknown和CsCysP的全长cDNA

4.3.4 CsPRP4、CsERF1、CsUnknown CscysP基因表达分析

4.4 CsPRP4、CsERF1、CsUnknown和CsCysP基因的生物信息学分析

4.4.1 CsPRP4

4.4.2 CsERF1

4.4.3 CsUnknow

4.4.4 CsCysP

第五章CsPRP4、CsERF和CsCysP基因RNAi载体构建及柑橘的转化

5.1实验材料与试剂

5.1.1实验材料

5.1.2菌株及载体

5.1.3试剂盒及试剂

5.2实验方法及步骤

5.2.1构建植物RNAi干扰载体的基本操作

5.2.2柑橘RNAi策略

5.2.3引物设计

5.2.4双酶切体系

5.2.5 RNAi载体的检测

5.3结果与分析

5.3.1目的基因的正、反向片段的TA克隆

5.3.2正向片段插入

5.3.3反向片段插入

第六章综合讨论

6.1芯片质量、数据分析的方法

6.1.1芯片实验数据分布特点

6.1.2芯片数据统计的主要方法

6.1.3差异表达基因的筛选方法

6.1.4影响筛选差异表达基因的因素

6.2 RTQ-PCR看家基因确定

6.3发掘脱落相关基因方法

6.3.1缺少乙烯途径之前的相关研究

6.3.2基因新功能发现

6.3.3受到乙烯抑制的基因缺乏关注

第七章展望

参考文献

致谢

附录

发表论文及参加课题一览表