莱氏野村菌(Nomuraea rileyi)的固体发酵及分生孢子活力的研究

摘要

莱氏野村菌(Nomuraea rileyi)是一种重要的昆虫病原真菌，能感染30多种鳞翅目昆虫，尤其对夜蛾科害虫的致病力很强，且常能引起病害流行，对人体和其他非目标生物包括昆虫寄生虫和捕食者无毒害作用，因而受到人们的重视[1]。然而，莱氏野村菌分生孢子粉的生产、在环境中的宿存能力等问题尚未获得圆满的解决，成为了影响其大规模开发和应用的制约因素。本实验采用的莱氏野村菌Cq菌株分离于罹病家蚕，已对生物学、几丁质酶发酵条件及几丁质酶基因的克隆与表达进行了研究报道[2-4]。本研究探索了莱氏野村菌高纯度分生孢子粉的生产，分析了大米发酵分生孢子对家蚕毒力的影响，调查了莱氏野村菌在土壤中的宿存能力和环境宿存后土壤中莱氏野村菌对家蚕毒力的影响，为莱氏野村菌的进一步研究开发和利用提供理论依据。主要的研究内容和结果如下：
　　 1.固体发酵与产孢条件优化
　　 以适度熟化的大米作为莱氏野村菌固体发酵的产孢基质，研究了米料不同装量厚度、补充氮源及氮源的添加量和补充水量对莱氏野村菌气生分生孢子的产粉量、含水量及产孢量的影响。结果表明，莱氏野村菌的生长需要一定量的氮源，在毫无氮源的大米培养基上培养时，虽可见有大量白色菌丝布满基质表面，但是即使培养26天也未见孢子产生；在大米中添加一定量的蛋白胨，酵母和硝酸钾都能提高莱氏野村菌孢子粉的产量，但是硝酸钾和蛋白胨对莱氏野村菌产孢的促进作用明显高于酵母，而从使用价格方面考虑，硝酸钾显然更适合作为大米的补充氮源；在直径为15cm的培养皿中，每皿装料90g时莱氏野村菌的产孢数达到最大，为0.91×109个孢子/g；硝酸钾添加量实验结果表明，莱氏野村菌产粉量随着硝酸钾的添加量的增加而逐渐增大，0.8％添加量处理时达到最大值29.41mg/g，而后增加硝酸钾的添加量，莱氏野村菌产粉量反而降低了；添水量实验结果表明，莱氏野村菌在每100g大米中添加1.5mL水处理时产孢数最大，为3.6×109个孢子/g。
　　 2.固体发酵分生孢子的毒力
　　 收集大米发酵获得的分生孢子粉，用0.02％的灭菌吐温-80配置成浓度分别为1.0×108个/mL、1.0×107个/mL、1.0×106个/mL、1.0×105个/mL、1.0×104个/mL、1.0×103个/mL的分生孢子悬液，感染四龄家蚕。实验结果表明：大米发酵所得的莱氏野村菌分生孢子保持了良好的毒力，生物测定结果表明，大米发酵所得的莱氏野村菌分生孢子悬浮液对家蚕的致死中浓度LC50为1mL1.43×105个，比斜面培养的莱氏野村菌分生孢子悬液对家蚕致死中浓度LC50为1mL1.33×105个略大，但是两者差异不显著，在1.0×105-1.0×100个分生孢子/mL浓度下，大米发酵所得分生孢子的LT50=9.81-14.88天，斜面培养分生孢子的LT50=9.88-14.94天，两者也不存在显著性差异，由此可见，利用大米对莱氏野村菌进行大规模发酵培养保持了其原有的毒力。
　　 3.土壤中的宿存动态与毒力变化
　　 将莱氏野村菌分生孢子与土壤混合，分别放置于室内及室外环境储存，在210d内利用选择性培养基定期检测土壤中的莱氏野村菌密度，并测定宿存对莱氏野村菌毒力的影响。结果表明：莱氏野村菌分生孢子在土壤中能够存活180d以上，土壤中有活力的莱氏野村菌的浓度随着宿存时间的增加而减少，室内及室外储存的土壤中莱氏野村菌的成菌落数从最初的17667±655×104CFUs/g分别减少到最后的3×104CFUs/g及2×104CFUs/g。在环境中宿存60天后，土壤中莱氏野村菌对家蚕保持着很强的毒力，家蚕的死亡率均达到90％以上；但120天后，土壤中的莱氏野村菌对家蚕的毒力均下降了80％以上。尽管土壤中宿存90天以上的莱氏野村菌对家蚕的毒力快速降低，但是通过培养基活化后，莱氏野村菌分生孢子恢复了几乎全部毒力。这就预示着莱氏野村菌能够在土壤中越冬，并保持了足够的数量和毒力引发来年真菌流行病的大爆发。