丹参骨宝对醋酸泼尼松致骨丢失大鼠骨髓微循环及脂肪分化的影响

摘要

[目的]： 临床上长期大剂量应用糖皮质激素(GC)可导致继发性骨质疏松症，其发病机理是综合性因素，其中骨髓微循环改变和骨髓脂肪分化增强是糖皮质激素引起骨质疏松症的重要机制。目前临床上防治糖皮质激素性骨质疏松症基本采用治疗原发性骨质疏松症的药物。本实验室开发研制的新药丹参骨宝(其主要成分为丹参水溶性成分丹参素、丹参酚B、原儿茶醛)，前期研究发现其在防治糖皮质激素性骨质疏松方面具有肯定疗效。为了进一步探讨丹参骨宝的作用机制，本实验应用醋酸泼尼松建立大鼠骨丢失模型，通过观察大鼠的骨组织形态计量学、骨密度，骨生物力学、骨髓微循环密度、骨髓基质干细胞PPARγ,的表达以及骨髓脂肪量等指标的变化，分析糖皮质激素诱发骨质疏松症的骨髓调控机理，并观察丹参骨宝是否对骨髓微循环改变和骨髓脂肪分化有影响，从而探讨其防治糖皮质激素性骨质疏松症作用机制，为从骨髓基质干细胞作为靶目标寻找有效对抗糖皮质激素性骨质疏松的药物提供实验依据。 [方法]： 6月龄SPF级雄性SD大鼠64只，随机分成8组，每组8只。基础组(BAS)未用药，在实验开始即处死；对照组(CON)每R给予蒸馏水5ml/kg灌胃；低剂量丹参骨宝组(DSL)每日给予丹参骨宝提取物含5mg丹参素/5ml/kg灌胃：激素组(GC)每日给予醋酸泼尼松混悬液3.5mg/5ml/kg灌胃；激素+罗盖全组(GC+CAL)每日给予醋酸泼尼松混悬液3.5mg/5ml/kg以及罗盖全0.045ug/5ml/kg灌胃；激素+低剂量丹参骨宝组(GC+DSL)每日给予醋酸泼尼松混悬液3.5mg/5ml/kg以及丹参骨宝提取物含5mg丹参素/5ml/kg灌胃；激素+高剂量丹参骨宝组(GC+DSH)每日给予醋酸泼尼松混悬液3.5mg/5ml/kg以及丹参骨宝提取物含10mg丹参素/5ml/kg灌胃；激素+丹参注射液组(GC+DSI)每日给予醋酸泼尼松混悬液3.5mg/5ml/kg灌胃以及丹参注射液12ml/kg腹腔注射。以上药物分为上下午两次给药，共计给药时间为12w。所有动物在实验结束前第14、13d及第4、3d各行颈部皮下注射钙黄绿素进行两次荧光标记。用药结束后心脏抽血处死大鼠，取血清行生化指标检测，取肾上腺、脾脏、比目鱼肌等计算器官指数，取左侧股骨行脱钙骨免疫组化染色，测定骨髓微循环密度(MVD)及PPARγ的表达量，取左侧胫骨不脱钙，行松质骨的骨形态计量学参数测量，取右侧股骨行骨生物力学及骨密度检测。 [结果]： 1.糖皮质激素对大鼠骨量、骨髓微循环和脂肪分化的影响(1)糖皮质激素可以导致大鼠骨丢失：醋酸泼尼松以3.5mg/kg/d灌胃给药方式作用12w后，大鼠胫骨上段松质骨骨小梁面积百分数比对照组下降43％(P<0.01)，骨小梁厚度下降23％(P<0.01)，而骨小梁分离度(Tb.Sp)显著增加，具有统计学意义。骨内膜面荧光周长百分数(％E-L.Pm)下降了50.7％，骨矿化沉积率(E-MAR)下降了36.3％，骨形成率(E-BFR/BS)下降了68.4％，均具有统计学意义(P<0.01)。同时我们观察到大鼠体重增长明显受抑制，免疫器官指数下降，骨骼肌重量/体重比显著下降。血清抗酒石酸酸性磷酸酶-5b含量明显增高(P<0.05)，而碱性磷酸酶含量显著降低(P<0.01)，并引发血清甘油三酯、低密度脂蛋白胆固醇以及血清葡萄糖含量升高(P<0.05)。 (2)糖皮质激素可以导致大鼠骨髓微循环密度(MVD)降低：在采甩vWF作为血管内皮标记物对血管进行免疫组化染色标记后，可清晰的看到模型组大鼠骨髓微血管呈现管腔狭窄、甚至闭合状态，数量显著减少，微循环密度降低，模型组大鼠MVD比对照组降低约19％(P<0.05)，具有统计学意义。 (3)糖皮质激素可以导致大鼠骨髓基质干细胞PPARγ蛋白的表达量增加，骨髓脂肪面积增加：在对大鼠骨髓基质干细胞进行免疫组化PPARγ蛋白特异性染色后，我们发现模型组大鼠骨髓基质干细胞中PPARγ蛋白的表达量明显增多，表现为细胞浆内蛋白着色显著增强，用计算机LeicaQ550CW图像分析系统进行灰度测定，模型组大鼠表达PPARγ蛋白的骨髓基质干细胞(阳性细胞)胞浆吸光度显著增强(P<0.01)，显示糖皮质激素能够促进骨髓基质干细胞的成脂分化，具有统计学意义。同时我们观察到模型组大鼠骨髓腔中脂肪细胞明显增多，脂肪面积增加，血窦被挤压闭合。 2.丹参骨宝及罗盖全、丹参注射液对大鼠骨量与骨髓微循环、脂肪分化的影响 (1)丹参骨宝对糖皮质激素致骨丢失大鼠的防治作用：低、高剂量丹参骨宝均可对抗糖皮质激素导致的大鼠胫骨上段松质骨骨小梁面积百分数(％Tb.Ar)、骨小梁数目(Tb.N)、骨小梁厚度(Tb.Th)的降低。激素+低剂量丹参骨宝组大鼠骨小梁面积百分数(％Tb.Ar)是激素组的176％(P<0.01)，并超过了对照组，骨小梁厚度(Tb.Th)是激素组的124％(P<0.01)，接近对照组水平。骨内膜面％E-L.Pm是激素组的164.7％(P<0.01)，E-MAR是激素组的137.1％(P<0.05)，E-BFR/BS是激素组的220.4％(P<0.01)。激素+高剂量丹参骨宝组大鼠骨小梁面积百分数(％Tb.Ar)是激素组的220％(P<0.01)，并超过了对照组，骨小梁厚度(Tb.Th)是激素组的149％(P<0.01)，超过了对照组。骨内膜面％E-L.Pm是激素组的191％(P<0.01)，E-BFR/BS是激素组的246.6％(P<0.01)，尚未达到对照组水平。并且低、高剂量丹参骨宝组大鼠的骨小梁分离度(Tb.Sp)较激素组均显著下降，具有统计学意义。同时丹参骨宝可显著对抗糖皮质激素抑制大鼠体重增长的作用，高剂量丹参骨宝可有效改善糖皮质激素所致的免疫器官萎缩现象，并可增加下肢骨骼肌的相对重量(P<0.01)。 激素+低剂量丹参骨宝组大鼠骨髓微循环密度显著增高，是激素组的120％(P<0.05)，并且观察到血管腔多呈开放扩张状态，同时骨髓腔脂肪面积明显减小，骨髓基质干细胞中PPARγ,蛋白的表达量也有所减少，阳性细胞吸光度减弱。激素+高剂量丹参骨宝组大鼠骨髓微循环密度显著增高，是激素组的132％(P<0.01)，血管明显扩张，血细胞充盈。骨髓腔脂肪面积显著减少，骨髓基质干细胞中PPARγ,阳性细胞吸光度明显减弱，具有统计学意义。丹参骨宝在改善骨髓微循环，逆转骨髓基质干细胞成脂分化方面显示出突出的作用。 (2)罗盖全、丹参注射液对糖皮质激素致骨丢失大鼠的防治作用：激素+罗盖全组大鼠胫骨上段松质骨骨小梁面积百分数(％Tb.Ar)是激素组的209％(P<0.01)，并超过了对照组，骨小梁厚度(Tb.Th)是激素组的117％(P<0.05)，骨小梁分离度(Tb.Sp)较激素组显著下降(P<0.01)，并显著低于对照组。该组％E-L.Pm、E-MAR、E-BFR/BS三项动态参数均显著高于激素组(P<0.01)。但罗盖全并没有改善骨髓微循环状况，与激素组相比，两组大鼠骨髓腔中微循环密度无显著性差异，罗盖全组大鼠骨髓腔微循环扩张不明显，并且该组大鼠骨髓基质干细胞表达PPARγ,蛋白仍较强，显示罗盖全未能逆转骨髓基质干细胞的成脂分化增多现象。 激素+丹参注射液组大鼠胫骨上段松质骨骨小梁面积百分数(％Tb.Ar)比激素组稍有所增加，但不具有统计学意义，骨小梁厚度(Tb.Th)是激素组的127％(P<0.05)，骨小梁分离度(Tb.Sp)与激素组相比无显著性差异，胫骨上段骨内膜面动态参数与激素组相比差异不大，丹参注射液未能显著对抗糖皮质激素抑制骨形成作用。并且该组大鼠骨髓基质干细胞表达PPARγ蛋白仍较强，显示出丹参注射液未能显著对抗糖皮质激素导致的骨髓基质干细胞成骨减少、成脂增多。而该组大鼠骨髓腔中微循环密度显著增加(P<0.05)，微血管明显扩张。 [结论]： 1.本研究表明糖皮质激素显著影响大鼠骨质及骨髓微循环和骨髓基质干细胞的成脂、成骨分化。其结果是明显减少大鼠松质骨骨小梁面积百分数，骨小梁厚度及骨小梁数量，增加了骨小梁分离度，并显著降低了骨内膜面荧光周长百分数、骨矿化沉积率和骨形成率，同时引起骨髓腔微循环障碍，微血管闭合，微循环密度降低，而骨髓基质干细胞表达PPARγ蛋白显著增强，骨髓脂肪面积明显扩大。因此推论，大剂量长期使用糖皮质激素导致骨质疏松症的主要机制，可能为激素诱导骨髓基质干细胞成脂分化增多、微循环障碍，进一步导致成骨小梁骨形成减少，骨量降低，最终导致骨质疏松。 2.丹参骨宝明显改善骨髓微循环，增加微循环密度，扩张血管，并且有效减弱骨髓基质干细胞PPARγ蛋白的表达，抑制其成脂，促进成骨，显著增加骨量，在对抗糖皮质激素所致大鼠骨丢失方面具有显著防治作用。罗盖全能够有效增加松质骨骨小梁，但不能改善骨髓微循环，未能逆转骨髓基质干细胞的成脂分化增多现象。丹参注射液能够有效改善骨髓微循环，但不能有效抑制骨髓基质干细胞的成脂分化，增加骨量作用不明显。丹参骨宝防治骨质疏松及促进骨形成方面效果明显优于罗盖全和丹参注射液，可能是治疗骨质疏松的理想药物。

目录

声明

1.前言

1.1研究背景

1.2研究目的

1.3研究内容

2.材料与方法

2.1实验动物与饲养条件

2.2药物的制备与配制

2.3主要试剂和仪器

2.4实验方法

2.5统计学分析

3结果

3.1醋酸泼尼松及药物对大鼠体质量及内脏重量的影响

3.2醋酸泼尼松及药物对大鼠血清生化指标的影响

3.3醋酸泼尼松及药物对大鼠尺骨物理指标的影响

3.4醋酸泼尼松及药物对大鼠股骨生物力学及骨密度的影响

3.5醋酸泼尼松及药物对大鼠胫骨近端松质骨形态计量学的影响

3.6醋酸泼尼松及药物对大鼠股骨远端骨髓脂肪面积的影响

3.7醋酸泼尼松及药物对大鼠股骨远端骨髓MVD、PPARγ表达的影响

4讨论

4.1醋酸泼尼松致大鼠骨丢失与骨髓微循环、脂肪分化的关系

4.2丹参骨宝、罗盖全及丹参注射液对激素致骨丢失大鼠骨组织、骨髓微循环和脂肪分化的影响及机制

5结论

参考文献

附图

文献综述：脂质代谢紊乱和骨质疏松

致谢

附录