D-半乳糖致雄性大鼠骨质疏松模型探讨及中药预防作用的观察

摘要

目的：
　　 由于引起男性骨质疏松的病因复杂,目前还没有理想的、特异的模型和防治的药物,用D-半乳糖造成雄性大鼠低转换骨质疏松模型,模拟男性骨质疏松症,通过观察骨无机物和有机物含量、骨形态计量学、骨生物力学、骨密度、血脂以及睾丸功能指标的变化,来探讨其骨质疏松发生的机制。同时,用D-半乳糖造成雄性骨质疏松模型,观察仙灵骨葆、人参须水提液、藿参合剂的预防作用,为预防男性骨质疏松筛选有效的治疗药物。
　　 方法：
　　 1.D-半乳糖致雄性大鼠骨质疏松模型的探讨
　　 选取3月龄清洁级雄性SD大鼠20只,随机分为2组,对照组(NS,10只):颈背部皮下注射0.9％生理盐水5ml/kg/d,蒸馏水5ml/kg,d灌胃;D-半乳糖模型组(DG,10只):颈背部皮下注射D-半乳糖100mg/kg/d,蒸馏水5ml/kg/d灌胃。
　　 各组大鼠饲养条件相同,每周记录体重情况,给药均为90d。实验结束前14、13两天皮下注射四环素(25mg/kg),前4、3两天给予皮下注射钙黄绿素(5mg/kg)进行体内荧光标记。实验结束时,心脏取血处死大鼠,分离血清测生化指标;取左侧胫骨及第四腰椎不脱钙包埋后分别制成骨切片(胫骨上段和腰椎)和骨磨片(胫骨中段),通过半自动图像分析系统进行松质骨和皮质骨的骨组织形态计量学测量;取右侧股骨和第五腰椎进行骨物理指标、骨密度、骨生物力学的测量;取左侧股骨烘干、消化,分成两份,分别使用ICP离子性发射光谱仪和羟脯氨酸试剂盒(经典法)检测其骨钙、磷以及骨胶原的含量;取睾丸称重,一侧作匀浆测生化指标,另一侧石蜡包埋切片,HE染色作组织形态学观察。
　　 2.几种中药对D-半乳糖致雄性大鼠骨质疏松的预防作用观察
　　 选取3月龄清洁级雄性SD大鼠60只,随机分为6组,对照组(NS,10只):颈背部皮下注射0.9%生理盐水5ml/kg/d,蒸馏水5ml/kg/d灌胃;D-半乳糖模型组(DG,10只):颈背部皮下注射D-半乳糖100mg/kg/d,蒸馏水5ml/kg/d灌胃;对照药复方司坦唑醇组(DG+SP,10只):颈背部皮下注射D-半乳糖100mg/kg/d,司坦唑醇0.54mg/kg/d+吡拉西坦432mg/kg/d灌胃;仙灵骨葆组(DG+GB,10只):颈背部皮下注射D-半乳糖100mg/kg/d,仙灵骨葆270mg/kg/d灌胃;人参须水提液组(DG+GS,10只):颈背部皮下注射D-半乳糖100mg/kg/d,人参须水提液5g/kg/d;藿参合剂组(DG+EG,10只):颈背部皮下注射D-半乳糖100mg/kg/d,藿参合剂(淫羊藿5/kg/d+人参须5g/kg/d)灌胃。
　　 各组大鼠饲养条件相同,每周记录体重情况,给药均为90d。实验结束前的荧光标记方法同前。实验结束时的取材及检测方法也按前面介绍的方法进行。
　　 结果：
　　 1.D-半乳糖可致雄性大鼠产生明显的骨质疏松
　　 大鼠颈背部皮下注射D-半乳糖100mg/kg/d90天后,大鼠骨形成抑制,骨吸收增加,出现低转换型骨质疏松:与NS组比较,给予D-半乳糖皮下注射90d后,骨无机物和有机质丢失,骨形成及骨矿化作用受到抑制,骨量显著丢失,骨质量降低,骨折风险增加。脂代谢异常,出现高脂血症。自由基损伤增加,睾丸功能减退。D-半乳糖导致的雄性大鼠低转换型骨质疏松模型具有以下特点:
　　 ①股骨矿物质的丢失:股骨钙、磷、Hyp含量分别均减少30.2%、28.5%、17.7%。骨形态计量学研究观察到D-半乳糖大鼠胫骨上段静态参数骨小梁面积百分率(%Tb.Ar)、骨小梁厚度(Tb.Th)和骨小梁数量(Tb.N)分别降低了34.4%、21%、26.7%;骨小梁分离度(Tb.Sp)增加了22.3%。单位骨小梁面积破骨细胞数(Oc.N)、破骨细胞周长百分数(%Oc.Pm)分别增加135%、66.9%。胫骨上段松质骨骨矿化沉积率(MAR)减少了43.8%,骨形成率指标下降。胫骨中段动静态参数无明显变化。腰椎松质骨的骨丢失不如胫骨上段明显,表现为Tb.N降低了28.1%、Oc.N增加了47.4%。股骨和腰椎的力学特性下降,股骨刚性系数、弯曲能量分别降低37.7%、29.2%,腰椎最大压缩载荷、弹性模量分别降低28.3%、35.4%。股骨骨密度下降。
　　 ②脂代谢异常:大鼠血清TG、LDL-C分别增加33.4%、51.9%,HDL-C降低了24.8%。
　　 ③睾丸组织自由基增加,睾丸功能受损:大鼠睾丸指数、SOD含量分别下降21.6%、4.1%,MDA含量增加60.1%。
　　 2.几种中药对D-半乳糖致雄性大鼠骨质疏松的预防作用
　　 (1)复方司坦唑醇可以明显增加D.半乳糖致骨质疏松大鼠的骨量,改善骨质量,其表现为:
　　 ①股骨钙含量增加40.2%。骨形态计量学研究观察到胫骨上段静态参数骨小梁面积百分率(%Tb.Ar)、骨小梁厚度(Tb.Th)和骨小梁数量(Tb.N)分别增加了50.5%、23.5%、30.5%和、骨小梁分离度(Tb.Sp)减少了56.2%。抑制破骨细胞的活性,使骨吸收参数单位骨小梁面积破骨细胞数(Oc.N)、破骨细胞周长百分数(%Oc.Pm)分别减少了56.2%、29.1%。胫骨上段骨形成和骨矿化增强MAR、BFR/BS、BFR/BV、BFR/TV较模型组分别增加60.9%、55.6%,36.5%、61.5%。对皮质骨动静态参数改善不明显,腰椎作用Tb.N较模型组增加26%,对大鼠股骨和腰椎生物力学性能和骨密度也无显著改善。
　　 ②对血脂代谢异常无显著改善。但能使TG、LDL-C分别降低19.5%和17.3%,HDL-C增加了19.2%。
　　 ③可对抗自由基损伤,改善大鼠睾丸结构和功能的作用。睾丸MDA含量降低了40.7%。
　　 (2)仙灵骨葆可明显抑制D.半乳糖大鼠破骨细胞的骨吸收作用,增强骨矿化作用:能显著对抗D-半乳糖造成的骨丢失,有效提高骨量。其表现为:
　　 ①股骨矿物含量显著增加,股骨钙磷含量分别增加了110%和78%,而对骨有机质含量影响不大。骨形态计量学骨上段松质骨骨小梁增多,连续性好,%Tb.Ar、Tb.Th、Tb.N分别增加了44.7%、23.3%和29.1%,Tb.Sp则下降了13.8%;而Oc.N和%Oc.Pm分别减少了55%和24.8%。骨形成和骨矿化增强,胫骨上段MAR、BFR/BS、BFR/TV较模型组分别增加46.3%、43.3%、49.7%。对DG大鼠皮质骨外膜面骨形成。腰椎骨小梁增多,%Tb.Ar、Tb.N分别增加48.3%、87%,Tb.Sp、Oc.N分别减少18.4%、4.2%。
　　 ②HDL-C含量增加30.4%,TG、LDL-C分别降低17.8%、16.1 o/o,可改善血脂代谢异常。
　　 ③可对抗自由基损伤,改善大鼠睾丸结构和功能。睾丸MDA含量降低了30.4%。
　　 (3)人参须水提液抑制骨吸收,促进骨矿化,增加骨量。主要表现为:①增加股骨矿物质含量,钙磷含量分别增加了43.2%和64.3%。骨形态计量学胫骨上段的骨小梁增多,%Tb.Ar增加37.9%,MAR增加42.6%,骨形成指标有增加趋势,Oc.N和%Oc.Pm分别减少了56.7%和23.1%。胫骨中段骨外膜的双荧光间距增大,动态参数%P-L.Pm、P-BFR/BS分别增加32.7%、34.9%。腰椎骨小梁增多,%Tb.Ar、Tb.N分别增加37.8%、69.6%。生物力学性能和骨密度无明显改善
　　 ②对血脂代谢异常无显著改善,但可使HDL-C含量增加11.6%,TG、LDL-C分别降低14.4%、16.5%。
　　 ③可对抗自由基损伤,改善大鼠睾丸结构和功能的作用。睾丸指数增加16.5%,MDA含量降低了40.9%。
　　 (4)藿参合剂能促进骨的形成、抑制骨的吸收,从而明显增加骨量,具体表现在:
　　 ①增加股骨矿物质含量,Ca2+、P3+分别增加了192.7%和72%。藿参合剂可以使D-半乳糖大鼠胫骨上段松质骨骨小梁增多,结构紧密,骨小梁面积百分率(%Tb.Ar)、骨小梁厚度(Tb.Th)和骨小梁数量(Tb.N)分别增加了42.7%、23.1%、29.6%;骨小梁分离度(Tb.Sp)下降12%。抑制破骨细胞的活性,使单位骨小梁面积破骨细胞数(Oc.N)、破骨细胞周长百分数(%Oc.Pm)分别减少57.1%、25.5%。胫骨上段骨矿化和骨形成显著增加,MAR、BFR/TV分别增加42.6%、29.5%。胫骨中段%P-L.Pm、P-BFR/BS分别增加35.9%、47.8%。腰椎骨小梁增多,%Tb.Ar、Tb.N分别增加46%、82.6%。
　　 ②对血脂异常无明显改善作用。但可使HDL-C含量增加17.90%,TG、LDL-C分别降低18.5%、16.2%。
　　 ③抗自由基损伤,改善大鼠睾丸结构和功能。睾丸体重指数增加了24.2%,MDA含量降低了40.7%。
　　 结论：
　　 每天按100mg/kg大鼠体重的剂量连续给予皮下注射D-半乳糖90天,可明显促进破骨细胞的骨吸收功能,同时抑制雄性大鼠的骨形成,导致骨明显丢失,呈现低转换型骨质疏松的表现;药物复方司坦唑醇、中药仙灵骨葆、人参须水提液和藿参合剂均可可有效预防D-半乳糖导致大鼠骨丢失的改变;人参须水提液和藿参合剂都是通过促进骨矿化,抑制破骨细胞的骨吸收来有效预防D-半乳糖导致雄性大鼠的骨改变,且藿参合剂优于人参须水提液,在对抗D-半乳糖导致的骨丢失上,与仙灵骨葆相当,具有成为理想的抗骨质疏松药物的良好前景。