狂犬病毒糖蛋白衍生肽作为新型穿膜肽携带荧光素酶的入脑研究

摘要

目前,神经退行性疾病、脑卒中和脑癌这些疾病相当难治疗的原因在于许多药物无法穿过血脑屏障(blood-brain barrier,BBB),特别是一些已经明确了对脑细胞具有神经保护作用的神经营养因子更是无法通过BBB。脑源性神经营养因子(brain-derired neurotrophic factor,BDNF)已经证实能够减少神经元的正常死亡,促进海马神经元,皮层神经元的修复和再生,但是其自身却难以通过血脑屏障。
　　 是否有一种穿膜肽(cell penetrating peptides,CPPs)既能够进入中枢神经系统也能作为载体运载大分子蛋白入脑呢?狂犬病毒糖蛋白(rabies virusglycoprotein)已被证实具有携带siRNA及EGFP等大分子穿过血脑屏障的能力。
　　 将狂犬病毒糖蛋白衍生肽(peptides derived from rabies virusglycoprotein,RDP)用罗丹明B标记,通过尾静脉注射入小鼠体内,分别于15min,5h颈椎脱臼处死小鼠,取脑、脊髓、心、肝、脾等组织,冷冻切片,通过荧光显微镜观察罗丹明B标记的RDP在不同时间点的体内分布。
　　 选取狂犬病毒糖蛋白衍生肽189和330多肽片段的基因序列,通过分子克隆的方法,将RDPl89和RDP330的核酸片段分别与萤火虫荧光素酶(FireflyLuciferase)基因序列重组,得到RDP189-luc,RDP330-luc的重组基因,同时构建没有RDP的荧光素酶重组质粒,作为对照。获得的阳性克隆,转入BL21大肠杆菌菌株后,加入终浓度为1.0 mM/L的IPTG在16℃,210r/m诱导6h,利用超声破碎的方法,离心获得目的蛋白,通过SDS-PAGE凝胶电泳检测融合蛋白为可溶性表达,并计算目的蛋白表达量。
　　 Folin-酚法测总蛋白含量,荧光素酶检测试剂盒检测目的蛋白的活性后通过尾静脉注射方法为小鼠给药。随机将健康昆明小鼠分为四组:第一组为空白对照组,注射生理盐水;第二组注射不含RDP的重组荧光素酶;第三组注射含有RDP189-luc的重组蛋白;第四组注射RDP330-luc的重组蛋白。15min,30min,1h,5h处死小鼠,取中枢神经组织,匀浆后检测荧光素酶活性及蛋白含量。
　　 实验结果表明,尾静脉给药15min后,在中枢神经系统中观察到罗丹明B标记的RDP片段发出的红光,分布于神经元细胞与神经胶质细胞,而在外周组织中的分布与对照组相似,这说明RDP能够透过血脑屏障快速入脑,并且主要分布于中枢神经系统。
　　 在RDP携带荧光素酶入脑实验中,15min时已在中枢神经系统中均检测到较高的荧光素酶活性,这说明RDP能够快速的通过血脑屏障,具有很强的嗜神经性,RDP330肽段携带荧光素酶活性海马区高于皮层,而RDP189融合蛋白活性皮层高于海马区。5h后荧光素酶活性与对照组相似,说明融合蛋白能够快速被生物体降解,具有很高的生物安全性。通过以上实验结果说明RDP能够携带荧光素酶这种蛋白大分子快速入脑,不同的RDP融合蛋白在脑内的分布不同,RDP330融合蛋白在海马区中活性比RDP189融合蛋白高,提示RDP330具有更强的嗜神经性,为RDP携带其他生物大分子入脑提供选择依据。