油茶组培体系的建立及VIGS系统在油茶、油桐基因功能研究中的应用

摘要

油茶(Camellia oleifera)为山茶科山茶属植物,是我国特有的油料作物。油茶籽中茶油的含量很高,而茶油中所含的不饱和脂肪酸等具有降低血清胆固醇、抗癌、抗氧化等多种生物活性,因此,茶油具有极高的营养价值。油茶在我国的分布范围较广,近年来,随着国家大力发展油茶产业,栽培规模进一步扩大,但是,总体上油茶种植存在经营粗放,产量低,且产量相差悬殊、极不稳定等问题。目前,国内主要采用油茶优良无性系造林,虽然该方法在一定程度上提高了茶油的产量和品质,但是仍远不能满足速生丰产油茶育苗的需求。因此,非常有必要开展油茶优良品种的组织快繁研究,该技术的成功可以有效解决油茶的快速繁育问题,具有重大的生产和科研价值。
　　 此外,现有的油茶品种的产量及品质均不高,导致人们种植的积极性不够,因此,对油茶品种进行分子改良,尤其是提高含油量,就显得十分紧迫。但是,由于油茶的组织再生和遗传转化研究非常困难,目前尚无成功报道,本研究拟将病毒诱导的基因沉默技术—VIGS用到油茶、油桐等油料作物中,希望建立一种快速鉴定基因功能的方法,为以后研究油茶基因功能奠定良好的基础。主要结果如下:
　　 1.油茶离体培养体系的建立
　　 以油茶1月生实生苗的茎段和叶片为材料,分别采用MS和WPM为基本培养基,附加不同浓度的2,4-D和KT,诱导愈伤组织,发现各种处理组合均能不同程度地诱导出愈伤组织,其最佳诱导处理组合为:MS+2,4-D(2 mg/L)+KT(1 mg/L)。
　　 2.油茶组培快繁体系的建立
　　 本研究采用油茶1月生实生苗带腋芽的茎段为材料,经初代培养—继代增殖培养—生根培养后获得了完整植株,其中初代培养基中最优激素组合为:6-BA3.0 mg/L+NAA0.01 mg/L,其诱导率高达98%;继代增殖培养基中最优激素组合为:6-BA1.5 mg/L+NAA0.2 mg/L,增殖系数达到6.5,且丛生芽的生长状况良好。再生植株生根采用瓶内生根和瓶外生根方法,结果发现,瓶内生根的方式其生根率较低,根系脆弱,导致移栽成活率也较低。而在瓶外生根方法中,采用100 mg/L IBA浸泡幼苗60 min和100 mg/LNAA浸泡幼苗45 min其生根率为分别为75.6%±0.08和80%±0.039,且根系粗壮,移栽成活率高。
　　 3.油茶、油桐PDS基因序列的克隆及VIGS病毒载体的构建
　　 通过RT-PCR方法获得油茶、油桐番茄红素脱氢酶(Phytoene desaturase,PDS)基因的部分序列,测序验证发现油茶、油桐PDS基因序列的相似性达到85%。双酶切PDS基因片段和烟草脆裂病毒载体(TRV2),构建为重组载体TRV2-PDS,然后将病毒载体转入农杆菌GV3101,获得GV3101-TRV2-CoPDS和GV3101-TRV2-VfPDS农杆菌。
　　 4.VIGS系统在油茶和油桐中的应用
　　 通过注射的方式将带有TRV2-CoPDS的农杆菌菌液导入油茶叶片中,三周后在油茶叶片中未观察到表型发生变化,但采用相同的方式,在被侵染的油桐植株新生叶片中发现了光漂白现象,五周后该现象进一步明显;而后将GV3101-TRV2-VfPDS导入油桐叶片中,沉默现象更为显著。提取被感染植株的总RNA,采用RT-PCR方法对病毒蛋白基因及PDS基因的表达水平进行分子检测,结果发现,在油桐中病毒蛋白基因的mRNA在植物体内大量积累,而PDS基因的表达水平显著下降,表明TRV病毒成功侵入油桐植株中,并在体内转移和复制。但在油茶中,未检测到病毒蛋白基因的表达,且PDS基因的表达水平变化不明显,表明烟草TRV病毒构建的VIGS系统在油茶中不能起作用,但可将油茶的未知功能基因通过该系统导入油桐中进行分子验证,我们的工作也为下一步大规模验证油桐基因功能奠定了基础。